Hsa

Jul 29, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11432 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Unsere vorherige Studie zeigte, dass hsa-miR-143-3p eine der am stärksten exprimierten miRNAs in angereicherten Hornhautepithelstammzellen (CESCs) ist. Daher zielt diese Studie darauf ab, die regulatorische Rolle von hsa-miR-143-3p bei der Aufrechterhaltung der Stammzellenbildung in CESCs aufzuklären. Die Zielgene von hsa-miR-143-3p wurden vorhergesagt und einer Signalweganalyse unterzogen, um die Ziele für Funktionsstudien auszuwählen. Primär kultivierte limbale Epithelzellen wurden mit hsa-miR-143-3p-Mimetikum, Inhibitor oder Rührsequenz unter Verwendung von Lipofectamine 3000 transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden auf (i) Koloniebildungspotenzial, (ii) Expression von Stammzellmarkern (SC) analysiert. Transkriptionsfaktoren (ABCG2, NANOG, OCT4, KLF4, ΔNp63), (iii) Differenzierungsmarker (Cx43), (iv) vorhergesagte fünf Ziele von hsa-miR-143-3p (DVL3, MAPK1, MAPK14, KRAS und KAT6A), ( v) MAPK-Signalregulatoren und (vi) Wnt-β-Catenin-Signalregulatoren durch qPCR, Immunfluoreszenzfärbung und/oder Western Blot. Eine hohe Expression von hsa-miR-143-3p erhöhte das Koloniebildungspotential (10,04 ± 1,35 %, p < 0,001) mit der Fähigkeit, holoklonähnliche Kolonien im Vergleich zur Kontrolle zu bilden (3,33 ± 0,71 %). Die mit Mimic behandelten Zellen hatten eine erhöhte Expression von SC-Markern, aber eine verringerte Expression von Cx43- und hsa-miR-143-3p-Zielen, die an Wnt-β-Catenin- und MAPK-Signalwegen beteiligt sind. Die Expression von β-Catenin, aktivem β-Catenin und ERK2 in mit hsa-miR-143-3p-Inhibitor transfizierten Zellen war höher als in den Kontrollzellen und die lokalisierte Kernexpression zeigte die Aktivierung der Wnt- und MAPK-Signalisierung an. Somit wurde die wahrscheinliche Assoziation von hsa-miR-143-3p bei der Aufrechterhaltung von CESCs durch Hemmung der Wnt- und MAPK-Signalwege angezeigt.

Hornhaut und Tränenfilm bilden das vordere transparente Fenster des Auges, das als physikalische Barriere zwischen der optischen und der äußeren Umgebung fungiert. Das Hornhautepithel ist die äußerste Schicht der Hornhaut und wird aus den Hornhautepithelstammzellen (CESCs) regeneriert, die in der Basalschicht des Limbusepithels vorhanden sind1. Diese im adulten Gewebe vorkommenden Stammzellen machen 3–5 % des gesamten Limbusepithels aus und sind normalerweise im Ruhezustand. Die Hauptfunktion von CESCs besteht jedoch darin, Prozesse wie Wundheilung2 und Homöostase3 zu steuern, um die Hornhauttransparenz aufrechtzuerhalten4. Der molekulare Mechanismus hinter der Aufrechterhaltung der Stammzellenbildung in CESCs ist immer noch unklar, einschließlich der epigenetischen Regulation durch microRNAs (miRNAs).

MiRNAs sind nichtkodierende einzelsträngige RNAs (18 bis 24 Nukleotide) und regulieren die Proteinspiegel der Ziel-Messenger-RNA (mRNA), ohne dass die Gensequenz verändert wird5. Es ist bekannt, dass MiRNAs aktiv an verschiedenen zellulären Prozessen wie Proliferation, Differenzierung, Zellstoffwechsel, Homöostase und Apoptose beteiligt sind6,7.

In unserer vorherigen Studie wurden CESCs mithilfe eines zweistufigen Protokolls8 auf 80 % angereichert und durch kleine RNA-Sequenzierung mit differenzierten zentralen Hornhautepithelzellen verglichen. Sechs miRNAs – hsa-miR-3168, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-10a-5p und hsa-miR-1910-5p – wurden identifiziert in den angereicherten CESCs stark exprimiert und durch qPCR validiert werden. Interessanterweise wurde basierend auf der In-situ-Hybridisierung mit fixierter Nukleinsäure festgestellt, dass hsa-miR-143-3p in der Basalschicht des Limbalepithels exprimiert wird, ausschließlich in den Ansammlungen kleiner Zellen, was auf eine mögliche Assoziation mit den CESCs hinweist9. Darüber hinaus wurde in dieser Studie die funktionelle Rolle von hsa-miR-143-3p in CESCs bewertet.

In embryonalen Stammzellen von Mäusen förderte hsa-miR-143-3p die Selbsterneuerung und erhöhte die Expression von Pluripotenzgenen wie OCT4, KLF4 und ESRRB10. Es war auch bekannt, dass Hsa-miR-143-3p verschiedene zelluläre Prozesse wie Differenzierung11, Proliferation12,13, Migration14, Apoptose15,16 und Zellzyklusregulation17 reguliert.

In dieser Studie wurden für die Funktionsstudien limbale Epithelzellen verwendet, die sowohl mit 2D- als auch mit 3D-Kultursystemen kultiviert wurden. Die „Real Architecture For 3D Tissue“ (3D-RAFTs) sind kollagenbasierte Hydrogele, in die Hornhaut-Stroma-Stammzellen (CSSCs) eingebettet sind, die als Modell der Nische von Hornhaut-Stroma-Stammzellen dienen18. Somit werden die auf den 3D-RAFTs kultivierten limbalen Epithelzellen eine enge Interaktion mit CSSCs haben, ähnlich wie in ihrer natürlichen Umgebung. Die mit dieser Technik hergestellten Epithel- oder Endothelgewebeäquivalente sind für die Transplantation geeignet und werden als Modell für die Untersuchung zellulärer Interaktionen und funktioneller Eigenschaften verwendet19,20. Die Aufklärung des Signalmechanismus hinter der Regulierung von CESCs durch hsa-miR-143-3p wird die Plattform für die Entwicklung neuer miRNA-basierter Kulturtechniken zur Erweiterung der CESCs für Transplantationen und Stammzelltherapien zur Behandlung von Patienten mit limbalem Stammzellmangel (LSCD) ebnen.

Die entkernten, nicht für eine Transplantation geeigneten Spenderkugeln und Limbusränder, die nach einer Hornhauttransplantation erhalten wurden (Spenderalter unter 73 Jahren), wurden von der Rotary Aravind International Eye Bank (Madurai, Indien), der Moorfields Eye Hospital Lions Eye Bank (London, Großbritannien) und Veneto Eye bezogen Bankstiftung (Venedig, Italien). Die nicht vaskularisierten Gewebe mit intaktem Limbus wurden nach gründlicher Untersuchung unter einem Stereo-Binokularmikroskop in der Studie verwendet. Der Umgang mit menschlichen Spendergeweben erfolgte gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki. Die Studie wurde vom Institutional Ethics Committee der Aravind Medical Research Foundation (RES2013038BAS) und dem Moorfields Eye Hospital / UCL Institute of Ophthalmology Eye Tissue Repository (10/H0106/57-2011ETR10) genehmigt. Die Einverständniserklärung für die Verwendung von Spenderaugen zu Forschungszwecken wurde von den gesetzlich bevollmächtigten Vertretern eingeholt.

Die Ziele von hsa-miR-143-3p wurden mit miRWalk (Version 3.0)21 und mirDIP (Version 4.1.1.6)22 vorhergesagt. Die Ziele, die in miRWalk und mirDIP gemeinsam waren, wurden ausgewählt, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Die ausgewählten Ziele wurden einer Analyse mit dem KEGG-Kartierungstool (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) und dem Suchpfad im KEGG-Mapper unterzogen und in Funktionskategorien gruppiert. Die mit der Regulierung von Stammzellen verbundenen Ziele wurden für die weitere Analyse ausgewählt.

Limbusepithelzellen wurden aus den 2 mm großen Limbusexplantaten kultiviert, die aus den Spenderkugeln oder Limbusrändern präpariert wurden. Die Explantate wurden mit der Epithelseite nach oben in die mit ergänztem Hormonepithelmedium (SHEM) media23 beschichtete 35-mm-Zellkulturschale (Nunc, Thermofisher Scientific, Massachusetts, USA) gegeben. Die Explantate wurden 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um ihre Befestigung an der Kulturschale zu ermöglichen. Die befestigten Explantate wurden dann in SHEM bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Medien wurden jeden zweiten Tag gewechselt, bis eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht war.

Für die Kultur primärer limbaler Epithelzellen wurden 3D-RAFTs mit CSSCs verwendet. Die limbalen Epithelzellen wurden durch Inkubation der limbalen Ränder in Dispase II (2 mg/ml) für 45 Minuten bei 37 °C erhalten. Anschließend wurde das Limbusepithel mit einem sterilen Skalpell abgekratzt. Das gesamte Limbusepithel wurde 30 Minuten lang einer Behandlung mit Trypsin (0,25 %) unterzogen, um einzelne Zellen zu erhalten24.

Für die CSSC-Kultur wurde die Limbusregion zusammen mit dem vorderen Stroma präpariert und 16 Stunden lang bei 37 °C einer Kollagenase-L-Behandlung (0,5 mg/ml) unterzogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation von der Lösung getrennt und das Pellet in 3 ml CSSC-Medium25 resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO2 in einem mit Fibronektin beschichteten T25-Kolben kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit frischem CSSC-Medium ergänzt und die nicht anhaftenden Zellen entfernt. Am zweiten Tag wurde eine selektive Trypsinisierung für CSSCs mit 0,05 % Trypsin-0,02 % EDTA (Invitrogen) durchgeführt und die CSSCs wurden in den mit frischem Fibronektin beschichteten T75-Kolben ausgesät. Die CSSCs wurden bei 37 °C in 5 % CO2 kultiviert, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wurde. Bei einer Konfluenz von 60–70 % wurden die Zellen mit einer Aussaatdichte von 3000 Zellen/cm2 in einem frischen Kolben subkultiviert. Zur Herstellung von 3D-RAFT wurden die CSSCs in Passage 4 verwendet, die durch Immunfärbung auf die Expression des CSSC-Markers validiert wurden.

Zur Herstellung von RAFT-TEs wurde das native AteloCell-Kollagen (Rinderdermis, 3 mg/ml, pH 3,0, saure Kollagenlösung I-AC) (Koken, Tokio, Japan) mit 10X Minimum Essential Medium (MEM) aus dem RAFT-Reagenz gemischt Kit (Lonza, Basel, Schweiz) im Verhältnis 8:1. Die Kollagenlösung wurde mit der Neutralisierungslösung (5 M Natriumhydroxid)26 auf einen pH-Wert zwischen 7,2 und 7,4 eingestellt. Die Lösung wurde 3 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Die CSSCs (30.000 Zellen/RAFT) wurden im CSSC-Medium resuspendiert und zur Kollagenlösung gegeben. Ein Volumen von 625 µl frisch zubereiteter Kollagenlösung mit CSSCs wurde in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen (Greiner, Stonehouse, UK) überführt und 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzt. Sobald sich die Kollagengele gebildet hatten, wurden RAFT-Absorber für 24-Well-Platten (hydrophile poröse Absorber) (Lonza) 30 Minuten lang auf die Oberfläche der Hydrogele aufgetragen. Dann wurden die Absorber vorsichtig entfernt und frisches CSSC-Medium zu den RAFT-TEs gegeben und bei 37 °C gelagert. Die limbalen Epithelzellen wurden in einer 24-Well-Platte mit einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen/RAFT ausgesät und in SHEM-Medium bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden kultiviert, bis sie eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichten, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wurde.

Die Transfektion von 70–80 % konfluenten menschlichen primären limbalen Epithelzellkulturen, die sowohl in 2D- als auch in 3D-Kultursystemen gezüchtet wurden, wurde unter Verwendung von Lipofectamine 3000-Transfektionsreagenz (Thermofisher Scientific) mit 25 nM hsa-miR-143-3p-Mimetikum (miScript miRNA Mimic) durchgeführt , Qiagen, Hilden, Deutschland) oder Inhibitor (miScript miRNA Inhibitor, Qiagen) oder transfektionskontrollverwürfelte Sequenz (AllStars Negative Control siRNA, Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Transfektion wurde 4 Stunden lang bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator durchgeführt und die Zellen wurden mit SHEM ergänzt. Nach 2 Tagen Kultur wurden die transfizierten Zellen für die folgenden Experimente geerntet (i) Koloniebildungstest, (ii) Immunfluoreszenzfärbung, (iii) RNA-Isolierung für die qPCR-Analyse und (iv) Proteinisolierung für Western Blot. Die Experimente wurden dreimal mit drei biologischen Proben wiederholt (n = 3).

Die hsa-miR-143-3p-Mimetika oder -Inhibitoren oder die durcheinandergemischten Kontroll-transfizierten Zellen wurden unabhängig voneinander auf einer mit Mitomycin C (4 µg/ml, Sigma-Aldrich) inaktivierten NIH 3T3-Mausfibroblasten-Feederschicht in einer 60-mm-Schale mit einer Aussaatdichte von 500 Zellen ausgesät pro Teller. Nach 12 Tagen Kultivierung in SHEM wurde die Feeder-Schicht mit 0,02 % EDTA-Lösung (Sigma-Aldrich) entfernt und die Kolonien in der Schale wurden nach 15-minütiger Fixierung 30 Minuten lang mit 1 % Rhodamin B (Roche, Basel, Schweiz) gefärbt mit 4 % Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich). Die Kolonien wurden mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und Bilder aufgenommen (Kamera Nikon D750, Japan). Die Koloniebildungseffizienz (CFE) wurde anhand der Formel berechnet: Anzahl der gebildeten Kolonien / Anzahl der ausgesäten Zellen × 100. Die Kolonien wurden im Hinblick auf ihre Größe und Morphologie gemäß der Definition von Barrandon und Green27 als holoklonartig bezeichnet.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) aus den drei Gruppen (i) mit Mimic behandelt, (ii) mit Inhibitor behandelt und (iii) mit Rührei behandelt isoliert. Für die reverse Transkription von RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers ein cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität (Thermofisher Scientific) verwendet. Die anschließende qPCR-Amplifikation wurde über 40 Zyklen unter Verwendung von KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Die Bedingungen des qPCR-Zyklus waren (i) anfängliche Aktivierung für 3 Minuten bei 95 °C, (ii) 40 Zyklen von (a) Denaturierung für 10 s bei 95 °C, (b) Annealing für 20 s bei 58 °C und (c ) Verlängerung für 30 s bei 72 °C und (iii) abschließende Verlängerung für 7 min bei 72 °C. Als Referenz-mRNA wurde Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) verwendet. Das Experiment wurde dreimal mit den im 2D-Kultursystem gezüchteten limbalen Epithelzellen wiederholt und die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) des Expressionswerts dargestellt. Die für qPCR verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt.

Die im 2D-Kultursystem gezüchteten transfizierten Zellen wurden nach 2 Tagen Kultur mit TrypLE Express (Gibco-Thermofisher Scientific) trypsinisiert und auf den Objektträgern (2,5 × 104 Zellen/Objektträger) zytozentrifugiert (400 U/min; 3 Minuten). Die Zellen wurden 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd bei 25 °C fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit 1X PBS (dreimal) gewaschen und mit 0,5 % Triton X-100 10 Minuten lang bei 25 °C permeabilisiert. Nach der Permeabilisierung wurden die Zellen mit 1X PBS gewaschen und 60 Minuten lang mit 5 % Ziegenserum (Sigma-Aldrich) blockiert. Die Zellen wurden dann mit primärem Antikörper, verdünnt in 2% Ziegenserum, über Nacht bei 4 ° C inkubiert (Ergänzungstabelle S2: Liste der für die Immunfärbung verwendeten Antikörper). Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen, und mit geeigneten sekundären Antikörpern (1:500), konjugiert mit Fluorophor (Alexa Fluor 488 oder Alexa Fluor 555), in PBS 60 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Die immungefärbten Zellen wurden unter Verwendung von Vectashield-Medium mit DAPI (Vector Laboratories Ltd, Peterborough, UK) nach gründlichem Waschen mit PBS montiert und mit einem Deckglas versiegelt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss LSM 700, Deutschland) zur Analyse des Lokalisierungsmusters der Proteinexpression aufgenommen. Für jeden verwendeten Primärantikörper wurde die entsprechende Isotypkontrolle als Negativkontrolle verwendet. Das Experiment wurde dreimal mit drei biologischen Proben wiederholt (n = 3). Die transfizierten Zellen auf 3D-RAFTs wurden direkt auf den Kulturplatten immungefärbt und keiner Trypsinbehandlung unterzogen. Zur Quantifizierung der Proteinexpression wurden die Bilder mit dem Fluoreszenzmikroskop Axioskop 2 (Zeiss) aufgenommen. Die Markerexpression wurde mit der Histogrammfunktion der HCImage-Analysesoftware basierend auf der mittleren Intensität des Fluoreszenzsignals in verschiedenen Kanälen quantifiziert. Die relative Proteinexpression basierend auf der Fluoreszenzintensität wurde wie von Lee et al.28 beschrieben quantifiziert

Zur Isolierung von Protein aus den transfizierten Zellen wurden die Zellen mit der Mischung aus RIPA-Lyse- und Extraktionspuffer (Thermo Scientific) und Halt-Protease-Inhibitor-Cocktail (Thermo Scientific) nach dem Waschen mit eiskaltem PBS (Gibco, Thermo Scientific) lysiert. Die Konzentration des isolierten Proteins wurde mit dem BCA Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific) geschätzt. Gleiche Mengen an extrahiertem Protein aus jeder Probe (20 µg) wurden durch 10 % Bis-Tris-Gel (NuPAGE, Thermo Scientific) unter reduzierenden Bedingungen nach 10-minütigem Erhitzen auf 95 °C zusammen mit LDS-Probenladepuffer (Thermo Scientific) getrennt. .

Die getrennten Proteine ​​wurden dann elektrolytisch auf eine PVDF-Membran (Invitrolon, Thermo Scientific) übertragen. Die Membran wurde mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörper (Ab) inkubiert (Ergänzungstabelle S3: Liste der für Western Blot verwendeten Primärantikörper). Die Membranen wurden dreimal gewaschen und mit dem entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper 1 Stunde lang bei 25 °C inkubiert (Cell Signaling Technology, Inc., Massachusetts, USA). Die Proteinbanden wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenzreagenzes nach gründlichem Waschen mit TBST (Millipore, Billerica, MA) nachgewiesen. In jedem Blot wurde GAPDH als normalisierende Referenz und Ladekontrolle verwendet. Das Experiment wurde dreimal unter Verwendung von limbalen Epithelzellen wiederholt, die sowohl im 2D- als auch im 3D-Kultursystem gezüchtet wurden, und die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Um mehrere Proteine ​​aus demselben Blot zu analysieren und ein wiederholtes Strippen zu vermeiden, wurde die Membran vor der Hybridisierung mit Antikörpern basierend auf dem Molekulargewicht des zu analysierenden Proteins geschnitten.

Für die statistische Analyse wurde die Statistiksoftware STATA 14.0 (Texas, USA) verwendet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Ein unabhängiger t-Test (parametrisch) wurde durchgeführt, um die beiden Versuchsgruppen zu vergleichen, wenn die Daten der Gaußschen Verteilung folgten, und der Mann-Whitney-U-Test (nicht parametrisch) wurde für die Daten verwendet, die einer nicht-Gaußschen Verteilung basierend auf der Shapiro-Wilk-Normalität folgten prüfen. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Genehmigung wurde vom Institutional Ethics Committee, der Aravind Medical Research Foundation (RES2013038BAS) und dem Moorfields Eye Hospital/UCL Institute of Ophthalmology Eye Tissue Repository 10/H0106/57-2011ETR10 eingeholt. Die in dieser Studie verwendeten Verfahren entsprechen den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki.

Für alle Spenderaugen, einschließlich der Minderjährigen, wurde eine Einverständniserklärung vom gesetzlich bevollmächtigten Vertreter eingeholt – entweder von den Eltern des Spenders oder von der Familie über die Augenbanken.

Für hsa-miR-143-3p identifizierten miRWalk und mirDIP 1229 bzw. 1661 Zielgene. Insgesamt 276 gemeinsame Zielgene wurden dem KEGG-Mapper vorgelegt und die mutmaßlichen Zielgene wurden in 231 KEGG-Pfade gruppiert. Zu den Signalwegen gehörten der MAPK-Signalweg, der Wnt-Signalweg, der mit der Pluripotenz von Stammzellen verbundene Signalweg und der PI3K-AKT-Weg. Zerzaustes Segmentpolaritätsprotein 3 (DVL3), Lysinacetyltransferase 6A (KAT6A), Kirsten-Ratten-Sarkom-2-Virus-Onkogen-Homolog (KRAS), Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1 (MAPK1)/ERK2 und Mitogen-aktivierte Proteinkinase 14 (MAPK14)/p38 MAPK waren die fünf Ziele, die an den Signalwegen beteiligt sind, die die Pluripotenz von Stammzellen regulieren, und sie wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Der KEGG-Signalweg29, der diese ausgewählten Zielgene von hsa-miR-143-3p zeigt, ist in Abb. S1 dargestellt.

Nach der Transfektion zeigten die mit hsa-miR-143-3p mimischen transfizierten Zellen eine erhöhte Expression von hsa-miR-143-3p (44,35 ± 14,57, p < 0,0001) und mit Inhibitor transfizierte Zellen hatten eine verringerte Expression (– 44,19 ± 4,39, p < 0,0001). ) im Vergleich zu denen der Kontrollzellen (Abb. 1A). Die Expression der fünf ausgewählten Ziel-mRNAs von hsa-miR-143-3p, (i) DVL3 (− 8,04 ± 0,47, p < 0,0001), (ii) KAT6A (− 2,18 ± 0,23, p < 0,0001), (iii) KRAS (− 8,31 ± 0,49, p < 0,0001), (iv) MAPK1 (− 5,59 ± 0,18, p < 0,0001) und (v) MAPK14 (− 5,56 ± 0,14, p < 0,0001) waren im Vergleich dazu in mimischen transfizierten Zellen herunterreguliert der Kontrollzellen. In den mit Inhibitoren transfizierten Zellen war ihre Expression jedoch signifikant hochreguliert (p < 0,0001) (Abb. 1B). In ähnlicher Weise wiesen die mimisch transfizierten Zellen auf Proteinebene eine verringerte Expression von DVL3 (0,73 ± 0,07, p = 0,0024), KRAS (0,87 ± 0,04, p = 0,0037), MAPK1 (0,56 ± 0,18, p = 0,0145) und MAPK14 (0,42 ±) auf 0,06, p = 0,0001) im Vergleich zu denen der Kontrollzellen durch Western Blot (Abb. 2, p < 0,05) und Immunfärbung (Abb. 3).

mRNA-Expressionsprofil von hsa-miR-143-3p-transfizierten Zellen. Expressionsprofil von (a) hsa-miR-143-3p, (b) seinen vorhergesagten Zielen, (c) Stammzellmarkern, (d) Differenzierungsmarker und (e) Wnt-Signalregulatoren nach Transfektion mit hsa-miR-143-3p Nachahmer und Inhibitor. Die relative mRNA/miRNA-Expression in mimischtransfizierten und inhibitortransfizierten Zellen wurde im Vergleich zur Kontrolle durch qPCR unter Verwendung der SYBR Green-Chemie quantifiziert. Jede Probe (n = 3) wurde dreifach getestet. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt und die relative Faltungsänderung der Expression (RQ) wurde mit der 2−∆∆CT-Methode nach Normalisierung mit GAPDH (Referenzgen)/RNU6B (Referenz-miRNA) berechnet. ***P < 0,0001.

Proteinexpressionsprofil von hsa-miR-143-3p-transfizierten Zellen, die in einem 2D-Kultursystem gezüchtet wurden. (a) Repräsentative Western-Blots von Proteinen von Interesse in drei Gruppen – hsa-miR-143-3p-Mimetikum, Inhibitor und Kontrolle (n = 3): (i) hsa-miR-143-3p-Ziele: DVL3, KRAS, MAPK1 und MAPK14, (ii) Stammzellmarker: ABCG2 und ΔNp63α (iii) Differenzierungsmarker: Cx43, (iv) Wnt-Signalregulatoren: AXIN2, β-Catenin und aktives β-Catenin und (v) MAPK-Signalregulatoren: p-ERK1/2 , p-p38, p-c-JUN, p-c-FOS, p-ATF2 und p-p53. GAPDH wurde als normalisierende Referenz und Belastungskontrolle verwendet. Balkendiagramme zeigen das relative Expressionsprofil der durch Western Blot quantifizierten Proteine ​​(b) hsa-miR-143-3p-Ziele (c) Stammzellmarker (d) Differenzierungsmarker (e) Wnt-Signalregulatoren (f) MAPK-Signalregulatoren. *P < 0,05; **P < 0,001. Die relativen Proteinexpressionswerte sind in Tabelle S4 und die Original-Western-Blot-Bilder in Abb. S2 aufgeführt.

Lokalisierung der Proteinexpression in hsa-miR-143-3p-transfizierten Zellen. Repräsentative konfokale Bilder transfizierter limbaler Primärkulturzellen, die auf DVL3, KRAS, MAPK1, MAPK14, β-Catenin, aktives β-Catenin, AXIN2, ABCG2, p63⍺ und Cx43 immungefärbt sind. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) und die Proteinexpression mit Alexa Fluor 555 (grün) gefärbt, mit Ausnahme von ABCG2 mit Alexa Fluor 488 (rot). Maßstabsbalken 50 µm. Die detaillierten Split-Channel-Bilder zusammen mit ihrer relativen Fluoreszenzintensität sind in Abb. S3 dargestellt.

Auf mRNA-Ebene zeigten die mimisch transfizierten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen eine signifikant höhere Expression von Stammzellmarkern – (i) universeller Stammzellmarker, ABCG2 (16,36 ± 1,41, p < 0,0001), (ii) limbaler Stammzellmarker, p63α ( 5,65 ± 0,79, p < 0,0001) und (iii) embryonale Stammzellmarker, OCT4 (5,28 ± 1,25, p < 0,0001), NANOG (6,17 ± 0,41, p < 0,0001) und KLF4 (9,00 ± 1,00, p < 0,0001) ( Abb. 1C). Im Gegensatz dazu war die Expression des Differenzierungsmarkers Connexin 43 (Cx43) in mimischen transfizierten Zellen verringert (− 7,27 ± 1,75, p < 0,0001). Andererseits war in den mit Inhibitoren transfizierten Zellen die Expression von Stammzellmarkern: ABCG2 (− 4,53 ± 0,34, p < 0,0001), p63α (− 10,13 ± 1,69), OCT4 (− 10,78 ± 4,31, p < 0,0001), NANOG (− 6,70 ± 2,00, p < 0,0001), KLF4 (− 18,13 ± 0,62, p < 0,0001) waren reduziert und die Cx43-Expression (6,85 ± 0,90, p < 0,0001) war im Vergleich zu Kontrollzellen erhöht (Abb. 1D, 3). .

Die konfokale Analyse der mimischen transfizierten Zellen ergab einen signifikanten Anstieg der Anzahl der Zellen (50,29 ± 1,81 %, p < 0,0001), die doppelt positiv für ABCG2 und p63α waren als die Kontrolle (11,96 ± 3,07 %, p = 0,0025). In mit Inhibitoren transfizierten Zellen gab es keine Zellen, die sowohl ABCG2 als auch p63α exprimierten (Abb. 3).

Die Western-Blot-Analyse von Stammzellmarkern und Differenzierungsmarkern in den transfizierten Zellen ergab, dass das Expressionsniveau von ABCG2 (2,14 ± 0,47, p = 0,0134) und ΔNp63α (2,07 ± 0,37, p = 0,0074) hochreguliert war und die Cx43-Expression (0,23). ± 0,05, p < 0,0001) wurde in mimischen transfizierten Zellen herunterreguliert (Abb. 2).

Um das Vorhandensein von Stammzellen in transfizierten Kulturen zu bestätigen, wurde ein Koloniebildungstest durchgeführt. Die mit Mimik behandelten Zellen zeigten einen erhöhten Prozentsatz der Koloniebildungseffizienz (10,04 ± 0,45, p = 0,0003) im Vergleich zu der Kontrolle (3,33 ± 0,23) und den mit Inhibitor behandelten Zellen (0,26 ± 0,08, p = 0,0003). Darüber hinaus gab es einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes holoklonähnlicher Kolonien (7,66 ± 2,45, p < 0,05) im Vergleich zu dem der Kontrolle (0,69 ± 2,08). Die mit dem Inhibitor behandelten Zellen produzierten keine derart größere Kolonie (Abb. 4). Somit erhöhte die höhere Expression von hsa-miR-143-3p die Effizienz der Koloniebildung und unterstützte die holoklonähnliche Koloniebildung.

Koloniebildungspotential hsa-miR-143-3p-transfizierter Zellen. (a) Repräsentative Rhodamin B-gefärbte limbale Epithelzellkolonien nach 12 Tagen Kultur in den drei Gruppen: hsa-miR-143-3p-Mimetikum, Inhibitor und transfizierte Kontrollzellen. (b) Das Balkendiagramm zeigt die Koloniebildungseffizienz der Zellen in den drei Gruppen. **P < 0,001.

Die Expression der Wnt-Signalregulatoren CTNNB1 (– 6,44 ± 1,14, p < 0,0001) und AXIN2 – 8,64 ± 4,06, p < 0,0001) wurde herunterreguliert und der Wnt-Signaltranskriptionsrepressor TCF3 (8,96 ± 0,71, p < 0,0001) wurde in transfizierten Mimics hochreguliert Gruppe verglichen mit der Kontrollgruppe (Abb. 1E), wohingegen es im Fall von mit Inhibitoren transfizierten Zellen umgekehrt war.

Auf Proteinebene zeigten Immunfärbung (Abb. 3) und Western Blots, dass die Expression von β-Catenin (0,35 ± 0,12, p = 0,0006), aktivem β-Catenin (0,61 ± 0,16, p = 0,0140) und AXIN2 (0,39 ± 0,21) betrug , p = 0,0075) waren in mimischen transfizierten Zellen reduziert. In mit Inhibitoren transfizierten Zellen war die Expression von β-Catenin (2,00 ± 0,62, p = 0,0493), aktivem β-Catenin (2,15 ± 0,43, p = 0,0095) und AXIN2 (3,69 ± 0,86, p = 0,0057) im Vergleich zu der von erhöht die Kontrolle (Abb. 2, p < 0,05).

Die MAPK-Signalregulatoren p-ERK1/2 (0,67 ± 0,13, p = 0,0128; 0,73 ± 0,12, p = 0,0183), p-p38 (0,47 ± 0,10, p = 0,0007), p–c-JUN (0,75 ± 0,14, p = 0,0342), p–c-FOS (0,55 ± 0,18, p = 0,0140), p-ATF2 (0,50 ± 0,09, p = 0,0008) und p-p53 (0,58 ± 0,17, p = 0,0115) wurden in der Nachahmung herunterreguliert transfizierte Zellen. Allerdings war die Expression von MAPK-Signalregulatoren in mit Inhibitoren transfizierten Zellen hochreguliert (Abb. 2, p < 0,05).

Die primären limbalen Epithelzellen, die auf den 3D-RAFT-TEs gezüchtet wurden, wiesen nach der Transfektion mit Mimetika eine verringerte Expression von (i) hsa-miR-143-3p-Zielen auf: DVL3 (0,69 ± 0,15, p = 0,0213), KRAS (0,47 ± 0,05, p = 0,0001), MAPK1 (0,76 ± 0,11, p = 0,0207) und MAPK14 (0,41 ± 0,05, p < 0,0001), (ii) Differenzierungsmarker: Cx43 (0,47 ± 0,08, p = 0,0004), (iii) Wnt-Signalregulatoren: AXIN2 (0,39 ± 0,09, p = 0,0004), β-Catenin (0,77 ± 0,09, p = 0,0135) und aktives β-Catenin (0,39 ± 0,05, p < 0,0001) und (iv) MAPK-Signalregulatoren: p-ERK1/2 (0,60 ± 0,06, p = 0,0004; 0,74 ± 0,02, p < 0,0001), p-p38 (0,50 ± 0,10, p = 0,0011), p–c-JUN (0,63 ± 0,17, p = 0,0211), p–c- FOS (0,70 ± 0,18, p = 0,0466), p-ATF2 (0,73 ± 0,08, p = 0,0044) und p-p53 (0,73 ± 0,12, p = 0,0193). Allerdings war die Expression der Stammzellmarker ABCG2 (1,88 ± 0,21, p = 0,0019) und ΔNp63α (2,31 ± 0,68, p = 0,0299) in mimischen transfizierten Zellen im Vergleich zur Kontrolle erhöht (Abb. 5, p < 0,05). . In den mimischen transfizierten Zellen war die Positivität von β-Catenin, aktivem β-Catenin und ERK2 auf die Zellmembran beschränkt. Bei den mit dem Inhibitor transfizierten Zellen wurde jedoch eine positive Reaktion sowohl in der Membran als auch im Zellkern beobachtet, was auf eine Kerntranslokation hindeutet (Abb. 6).

Proteinexpressionsprofil von hsa-miR-143-3p-transfizierten Zellen, die im 3D-RAFT-Kultursystem gezüchtet wurden. (a) Repräsentative Western-Blots von Proteinen von Interesse in drei Gruppen – hsa-miR-143-3p-Mimetikum, Inhibitor und Kontrolle – transfizierte 3D-RAFT-kultivierte Zellen (n = 3): (i) hsa-miR-143-3p-Ziele: DVL3 , KRAS, MAPK1 und MAPK14, (ii) Stammzellmarker: ABCG2 und ΔNp63α (iii) Differenzierungsmarker, Cx43, (iv) Wnt-Signalregulatoren: AXIN2, β-Catenin und aktives β-Catenin und (v) MAPK-Signalregulatoren: p-ERK1/2, p-p38, p–c-JUN, p–c-FOS, p-ATF2 und p-p53. GAPDH wurde als normalisierende Referenz und Belastungskontrolle verwendet. Balkendiagramme zeigen das relative Expressionsprofil der durch Western Blot quantifizierten Proteine ​​(b) hsa-miR-143-3p-Ziele (c) Stammzellmarker (d) Differenzierungsmarker (e) Wnt-Signalregulatoren (f) MAPK-Signalregulatoren. *P < 0,05; **P < 0,001; ***P < 0,0001. Die relativen Proteinexpressionswerte sind in Tabelle S5 und die Original-Western-Blot-Bilder in Abb. S4 aufgeführt.

Lokalisierung der β-Catenin-, aktiven β-Catenin- und ERK2-Expression in hsa-miR-143-3p-transfizierten Zellen in 3D-RAFT. Repräsentative konfokale Bilder transfizierter primärer limbaler Epithelzellen, die auf 3D-RAFT-TEs gezüchtet wurden und auf (a) β-Catenin, (b) aktives β-Catenin und (c) ERK2 immungefärbt sind. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) und die Proteinexpression mit Alexa Fluor 555 (rot) gefärbt. Im Vergleich zu den Kontroll- und mimischen transfizierten Zellen war die Expression von β-Catenin, aktivem β-Catenin und ERK2 in mit Inhibitoren transfizierten Zellen höher, zusammen mit einer starken Kerntranslokation. Die relativen Proteinexpressionswerte basierend auf der Fluoreszenzintensität sind in Abb. S5 dargestellt. Maßstabsbalken 50 µm. Die nukleare Lokalisierung von aktivem β-Catenin und ERK2 weist auf die Aktivierung der Wnt-β-Catenin- bzw. MAPK-Signalisierung hin.

Kürzlich wurde in verschiedenen Stammzellen eine regulatorische Rolle für miRNAs identifiziert. MiRNAs modulieren Signalwege durch selektives Targeting der beteiligten Moleküle30,31. Zur Aufrechterhaltung hämatopoetischer Stammzellen regulierte miR-143 die Smad-abhängige TGFβ/DAB2-Signalübertragung herunter32. In mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks und apikalen papillären Stammzellen regulierte miR-143-3p den Differenzierungsprozess negativ, indem es auf das knochenmorphogenetische Protein 233 bzw. den Kernfaktor I-C34 abzielte. Im Gegensatz dazu unterstützte es die Differenzierung in Stammzellen der menschlichen Zahnpulpa, indem es auf den Osteoprotegerin-RANK-Signalweg abzielte35. Obwohl die Expression von hsa-miR-143-3p in verschiedenen Augengeweben identifiziert wurde11,36,37,38, wurde sein funktioneller Zusammenhang noch nicht untersucht.

Unsere vorherige Studie zur miRNA-Profilierung angereicherter CESCs9 deutete auf die mögliche Rolle von hsa-miR-143-3p bei der Aufrechterhaltung der Stammzellenbildung in CESCs hin. Darüber hinaus erhöhte die ektopische Expression von hsa-miR-143-3p in dieser Studie das Koloniebildungspotenzial kultivierter limbaler Epithelzellen zusammen mit einer erhöhten Anzahl holoklonartiger Kolonien basierend auf Größe und Morphologie. Darüber hinaus war die Expression von Stammzellmarkern in den mimischen transfizierten Zellen erhöht und die Expression von Differenzierungsmarkern verringert. Somit wiesen diese Ergebnisse insgesamt auf den Zusammenhang von hsa-miR-143-3p mit der Aufrechterhaltung der Stammzellenbildung in CESCs hin.

Es wurde über einen Zusammenhang von Wnt- und MAPK-Signalen bei der Aufrechterhaltung und Differenzierung von Stammzellen berichtet. In limbalen Explantatkulturen wurden durch Hemmung des Wnt-Signals28 und des MAPK-Signals39,40 die Expression von Stammzellmarkern (ABCG2 und p63α) und die Effizienz der Koloniebildung erhöht. In der Suspensionskultur isolierter limbaler Epithelzellen führte die Aktivierung der Wnt-Signale41 und MAPK-Signale42 jedoch zu einer verringerten Koloniebildungseffizienz und der Anzahl der Zellen, die in kultivierten limbalen Kolonien hohe Mengen an p63α exprimierten.

Die mimischen transfizierten Zellen zeigten eine verringerte Expression von vier vorhergesagten Zielen von hsa-miR-143-3p: KRAS, MAPK1 (ERK2), MAPK14 (p38α) und DVL3. Obwohl die vorhergesagten Ziele herunterreguliert wurden, hat die Studie nicht validiert, ob diese Ziele die direkten Ziele von hsa-miR-143-3p sind. Berichten zufolge war KRAS unter den Zielen ein bekanntes direktes Ziel von miR-143-3p43,44,45. Die regulatorische Rolle der vorhergesagten Ziele von hsa-miR-143-3p bei der Wnt- und MAPK-Signalübertragung wurde tabellarisch aufgeführt (Tabelle 1). Die Expression von Wnt-Signalregulatoren: AXIN2, β-Catenin, aktives β-Catenin und MAPK-Signalregulatoren: p-ERK1/2, p-p38, p–c-JUN, p–c-FOS, p-ATF2, p- p53 wurde in mimischen transfizierten Zellen herunterreguliert, was auf eine Hemmung der Wnt-β-Catenin- und MAPK-Signalübertragung hinweist.

Basierend auf den obigen Beobachtungen haben wir einen wahrscheinlichen Wirkungsmechanismus von hsa-miR-143-3p auf die Wnt- und MAPK-Signalübertragung vermutet, der in Abb. 7 zusammengefasst ist.

Postulierter Mechanismus der Regulierung der Wnt- und MAPK-Signalübertragung durch hsa-miR-143-3p. Hsa-miR-143-3p hemmt die Wnt-Signalisierung durch Herunterregulieren der Expression seiner Ziele (i) MAPK14 (p38) und KRAS-hemmt GSK3β, einen Repressor der Wnt-Signalisierung, (ii) DVL3- aktiviert die Wnt-Signalisierung durch Dissoziation des Zerstörungskomplexes und (iii) MAPK1 (ERK2) – aktiviert den Wnt-Co-Rezeptor LRP6 durch Phosphorylierung und initiiert die Wnt-Signalisierung. Hsa-miR-143-3p hemmt die MAPK-Signalübertragung durch Herunterregulierung seiner Ziele (i) DVL3- initiiert die JNK-MAPK-Signalisierung durch Aktivierung des RAC-Proteins (ii) KRAS- aktiviert die ERK-MAPK-Signalisierung durch Aktivierung des RAF-Proteins (iii) MAPK14- Aktivator von p38-MAPK-Signalisierung und (iv) MAPK1-Aktivator der ERK-MAPK-Signalisierung.

Hsa-miR-143-3p hemmt die Wnt-Signalübertragung, indem es die Expression seiner Ziele herunterreguliert. (i) MAPK14 (p38) – hemmt GSK3β, einen Repressor der Wnt-Signalübertragung. (ii) DVL3 aktiviert die Wnt-Signalübertragung, indem es den Zerstörungskomplex dissoziiert und p38 initiiert vermittelte GSK3β-Hemmung (iii) MAPK1 (ERK2) aktiviert den Wnt-Co-Rezeptor LRP6 durch Phosphorylierung und erleichtert dadurch die Wnt-Signalisierung und (iv) KRAS hemmt GSK3β und stabilisiert das β-Catenin durch direkte Phosphorylierung.

Hsa-miR-143-3p hemmt die MAPK-Signalübertragung, indem es die Expression seiner Ziele herunterreguliert. (i) Die MAPK14-Aktivierung von MAPK14 ist der wesentliche Schritt und markiert die Aktivierung der p38-MAPK-Signalisierung. (ii) DVL3 initiiert die JNK-MAPK-Signalisierung durch Aktivierung des RAC-Proteins, (iii) MAPK1-Aktivierung und Translokation von MAPK1 in den Zellkern ist der entscheidende Schritt bei der Aktivierung des ERK-MAPK-Signals und (iv) KRAS aktiviert den ERK-MAPK-Signalweg durch Aktivierung des RAF-Proteins.

Der wahrscheinliche Zusammenhang von hsa-miR-143-3p mit der Aufrechterhaltung von CESCs durch Herunterregulierung von Schlüsselproteinen, die an der Wnt- und MAPK-Signalübertragung beteiligt sind, wurde in dieser Studie unter Verwendung primärer limbaler Epithelzellen nachgewiesen, die in 2D- und 3D-Kultursystemen gezüchtet wurden. Weitere funktionelle Studien sind unerlässlich, um zu bestätigen, ob die vorhergesagten Gene die direkten Ziele von hsa-miR-143-3p sind und welche Rolle sie bei der Aufrechterhaltung der Stammzellenfunktion spielen.

Der während der aktuellen Studie generierte und analysierte Datensatz ist im figshare-Repository verfügbar, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.19242561.v1

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Die Studie wurde vom Department of Biotechnology, Indien, finanziert (Nr. BT/PR8712/AGR/36/762/2013). Die Autoren danken dem Council of Scientific & Industrial Research (CSIR), Indien, für das Senior Research Fellowship (09/931(0007)/2018-EMR-I) und der Commonwealth Scholarship Commission UK für das Commonwealth Split-Site-Stipendium (INCN-2018-72). nach Lavanya Kalaimani. Herrn D. Saravanan, Manager, Rotary Aravind International Eye Bank, Madurai, Indien, für seine wertvolle Hilfe bei der Probenentnahme für die Studie. Herr Manojkumar Kumaran, Abteilung für Bioinformatik, Aravind Medical Research Foundation, Madurai, Indien, für seine Hilfe bei der Erstellung der Zahlen. Herr Mohammed Sithiq Uduman, Abteilung für Biostatistik, Aravind Eye Care System, Madurai, Indien, für seine Hilfe bei der Statistik. Dr. R. Kumaragurupari, Chefbibliothekarin, Aravind Eye Care System, für ihre wertvolle Hilfe bei der Formatierung von Referenzen und der Literatursammlung.

Abteilung für Immunologie und Stammzellbiologie, Aravind Medical Research Foundation, Madurai, Tamil Nadu, 625020, Indien

Lavanya Kalaimani, Muthukkaruppan Veerappan und Gowri Priya Chidambaranathan

Abteilung für Bioinformatik, Aravind Medical Research Foundation, Madurai, Tamil Nadu, Indien

Bharanidharan Devarajan

Hornhautklinik, Aravind Eye Hospital und Postgraduierteninstitut für Augenheilkunde, Madurai, Tamil Nadu, Indien

Venkatesh Prajna Namperumalsamy

Abteilung für Biotechnologie, Aravind Medical Research Foundation – angeschlossen an die Alagappa University, Karaikudi, Tamil Nadu, Indien

Lavanya Kalaimani & Gowri Priya Chidambaranathan

Institut für Augenheilkunde, University College London, London, Großbritannien

Lavanya Kalaimani & Julie T. Daniels

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Methodik, Datenanalyse und -interpretation, Manuskripterstellung: LK; Studiendesign, Datenanalyse und Interpretation: BD; Dateninterpretation, Korrekturlesen und Ressourcen: VPN; Studiendesign, Dateninterpretation, Korrekturlesen: MV; Studiendesign, Datenanalyse und -interpretation, Korrekturlesen: JTD; Studiendesign, Finanzierungseinwerbung, Datenanalyse und -interpretation, Manuskripterstellung: GPC

Korrespondenz mit Gowri Priya Chidambaranathan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kalaimani, L., Devarajan, B., Namperumalsamy, VP et al. Hsa-miR-143-3p hemmt die Wnt-β-Catenin- und MAPK-Signalübertragung in menschlichen Hornhautepithelstammzellen. Sci Rep 12, 11432 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15263-x

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Eingegangen: 18. Februar 2022

Angenommen: 21. Juni 2022

Veröffentlicht: 06. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15263-x

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