Augentropismus von SARS

Jul 23, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7675 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Obwohl bei Patienten mit COVID-19 über Augenmanifestationen berichtet wird, besteht kein Konsens über den Augentropismus von SARS-CoV-2. Hier infizieren wir transgene K18-hACE2-Mäuse auf verschiedenen Wegen mit SARS-CoV-2. Wir beobachten Augenmanifestationen und Netzhautentzündungen mit der Produktion proinflammatorischer Zytokine in den Augen intranasal (IN) infizierter Mäuse. Eine intratracheale (IT) Infektion führt zur Ausbreitung des Virus von der Lunge über den Trigeminus- und den Sehnerv in das Gehirn und die Augen. Augen- und neuronale Invasionen werden durch eine intrazerebrale (IC) Infektion bestätigt. Bemerkenswert ist, dass das Eye-Drop-Virus (ED-Virus) keine Lungeninfektion verursacht und mit der Zeit nicht mehr nachweisbar ist. Die okulare und neurotrope Verteilung des Virus in vivo ist in der Fluoreszenzbildgebung mit einem infektiösen Klon von SARS-CoV-2-mCherry ersichtlich. Die augentropischen und neuroinvasiven Eigenschaften von SARS-CoV-2 werden bei Wildtyp-Syrischen Hamstern bestätigt. Unsere Daten können das Verständnis der Virusübertragung und der klinischen Merkmale von SARS-CoV-2 verbessern und zur Verbesserung der COVID-19-Kontrollverfahren beitragen.

Mehrere Atemwegsviren, wie Adenoviren der Spezies D und Influenzaviren des Subtyps H7, zeigen einen Augentropismus und verursachen Augenerkrankungen beim Menschen1. Während bei Patienten mit COVID-192 häufig über Augenmanifestationen und -anomalien berichtet wurde,3 bleiben der Augentropismus und die Pathologien von SARS-CoV-2 unklar. Bei der Analyse der Bindehautabstriche von drei Patienten mit COVID-19 und bilateraler Konjunktivitis4 sowie in 16 Kammerwasser- und Glaskörperproben aus Obduktionsfällen5 wurde keine virale RNA nachgewiesen. Im Gegensatz dazu berichtete eine Querschnittsstudie in Italien über das Vorhandensein viraler RNA in den Bindehautabstrichen von 52 von 91 Patienten mit COVID-19, wobei die Nachweisrate bei Patienten mit schwerer Erkrankung hoch war6. Andere Querschnittsstudien in China7 und Brasilien8 sowie Obduktionen9,10 berichteten ebenfalls über den Nachweis viraler RNA in Bindehautabstrichen oder im Kammerwasser von Patienten mit oder ohne Augenmanifestationen.

Da die Augenoberfläche eine zusätzliche Schleimhautoberfläche darstellt, die infektiösen Aerosolen ausgesetzt ist, gelten die Augen als potenzieller Übertragungsweg von SARS-CoV-2. Tatsächlich wird der SARS-CoV-2-Rezeptor auf der menschlichen Augenoberfläche exprimiert11,12. Deng et al. zeigten, dass SARS-CoV-2 nach einer Bindehautimpfung möglicherweise über die Bindehaut bei Rhesusaffen eindringt13. Darüber hinaus kann SARS-CoV-2 aus menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnene Augenepithelzellen14 und menschliche Bindehautepithelzellen15 infizieren. Daher muss untersucht werden, ob die Augen als primäre oder sekundäre Viruseintrittsorte fungieren können, um präventive oder therapeutische Strategien gegen die Übertragung von SARS-CoV-2 zu entwickeln.

In dieser Arbeit bewerten wir den Augentropismus und die mögliche Augenübertragung von SARS-CoV-2 anhand transgener K18-hACE2-Mäuse und syrischer Wildtyphamster. Mithilfe verschiedener Inokulationswege demonstrieren wir den Augentropismus von SARS-CoV-2 über die neuronale Invasion von Trigeminus- (TN) und Sehnerven (ON) im Mausmodell. Mithilfe infektiöser SARS-CoV-2-mCherry-Klone und einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem untersuchen wir die okulare und neurotrope Verteilung des Virus in vivo. Darüber hinaus liefern wir Belege für die augentropischen und neuroinvasiven Eigenschaften von SARS-CoV-2 bei Wildtyp-Hamstern.

In einer früheren Studie wurde berichtet, dass eine Infektion der Augen mit dem Zika-Virus (ZIKV) zur Entwicklung von Konjunktivitis und Panuveitis führte und eine Entzündung im Uvealgewebe eines Mausmodells verursachte16. Um zu untersuchen, ob die Pathogenese der Augenerkrankung als Reaktion auf die SARS-CoV-2-Infektion bei K18-hACE2-Mäusen verursacht wird, infizierten wir Mäuse intranasal (IN) mit 104 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des Virus oder dem gleichen Volumen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Scheingruppe). In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen17 beobachteten wir 7 Tage nach der Infektion einen Gewichtsverlust von 20 % (dpi; Abb. 1a) und eine Mortalität bei 8 dpi (Abb. 1b). Bemerkenswert ist, dass bei 6 dpi bei 25 % der infizierten Mäuse Tränenfluss und Augenausfluss auftraten (Abb. 1c). Anschließend untersuchten wir das Vorhandensein von SARS-CoV-2 in den Augen von Mäusen nach einer IN-Infektion. Bei 6 dpi wurde die Viruslast in Lunge und Augen, einschließlich Anhängseln, mittels Plaque-Assay bestimmt. Der aus den Augen gewonnene infektiöse Virustiter war genauso hoch wie der aus der Lunge (~106 PFU/g; Abb. 1d). In Anbetracht des Nachweises viraler RNAs in Tränen von Patienten mit SARS-CoV18 und SARS-CoV-219 haben wir die viralen RNA-Kopien in der Tränendrüse bei 6 dpi mittels RT-qPCR untersucht, die auf das virale Nukleokapsid-Gen abzielen (Abb. 1e). Interessanterweise war die Viruslast der Tränendrüse deutlich geringer als die der Augen und ähnelte der in der Milz (~104 virale RNA-Kopien pro Mikrogramm Gesamt-RNA), einem der Gewebe, das vernachlässigbar anfällig für die Infektion ist20. Diese Ergebnisse wurden auch bei weiblichen K18-hACE2-Mäusen bestätigt, was darauf hindeutet, dass dem Virus keine Geschlechts- oder Geschlechtsspezifität fehlte (ergänzende Abbildung 1). Als nächstes untersuchten wir die Netzhautschnitte von IN-infizierten Mäusen bei 6 dpi, um das virale Spike (S)-Protein mittels Immunfluoreszenzfärbung nachzuweisen. Das ACE2-Protein wurde in der Netzhaut beobachtet (ergänzende Abbildung 2). Das S-Protein wurde hauptsächlich in der Ganglienzellschicht der Netzhaut beobachtet, die aus retinalen Ganglienzellen besteht, deren Axone den Sehnerv, das Chiasma und den Sehnerventrakt bilden (Abb. 1f). Wir beobachteten auch die Co-Lokalisierung des S-Proteins und von γ-Synuclein, einem Marker für Ganglienzellen der Netzhaut21, in der Ganglienzellschicht, was darauf hindeutet, dass es sich bei den infizierten Zellen möglicherweise um Ganglienzellen der Netzhaut handelte (ergänzende Abbildung 3). Diese Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von infektiösem SARS-CoV-2 in den Augen, was darauf hindeutet, dass die Augen das Ziel einer SARS-CoV-2-Infektion waren, möglicherweise über eine neuronale Invasion.

Acht bis neun Wochen alte männliche K18-hACE2-Mäuse wurden intranasal scheininfiziert oder mit 104 PFU SARS-CoV-2 infiziert (n = 5 für schein- bzw. SARS-CoV-2-infizierte Mäuse; Schein, Grau; SARS-CoV-2, Rot). a Veränderungen des Körpergewichts werden als Prozentsatz des Ausgangsgewichts angezeigt. b Das Überleben wurde bei der angegebenen dpi bewertet. c Repräsentatives Bild von Tränen und Augenausfluss bei SARS-CoV-2-infizierten Mäusen bei 6 dpi (rechts) im Vergleich zu denen bei scheininfizierten Mäusen (links). d Die Viruslast in Lunge und Augen, einschließlich Anhängseln, wurde mithilfe eines Plaque-Assays bei 6 dpi analysiert. e Die viralen RNA-Spiegel in Lunge, Gehirn, Augen, einschließlich Gliedmaßen, Tränendrüse, Ohrspeicheldrüse und Milz wurden mittels RT-qPCR bei 6 dpi beurteilt. Virale RNA-Kopien wurden abgeschnitten (104 Kopien/μg). Eine gestrichelte Linie zeigt die viralen RNA-Spiegel der Milz als Nachweisgrenze an. f Repräsentative konfokale Bilder von immunfluoreszenzgefärbten Netzhautschnitten IN-infizierter Mäuse (n = 3 pro Gruppe) für virales Spike (S)-Protein (rot) bei 6 dpi. Die DAPI-Färbung (blau) wurde verwendet, um Kerne der Ganglienzellschicht (GCL), der inneren Kernschicht (INL) und der äußeren Kernschicht (ONL) im Netzhautquerschnitt sichtbar zu machen. Maßstabsbalken = 100 μm. Symbole stellen Mittelwerte ± SEM dar. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe mehrerer zweiseitiger t-Tests (a), eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests (d) oder einer einfaktoriellen ANOVA (e) ermittelt. SARS-CoV-2: schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2; PFU-Plaque-bildende Einheit, vRNA virale RNA, dpi Tage nach der Infektion.

Wir untersuchten die histopathologischen und entzündlichen Veränderungen als Reaktion auf die Infektion weiter anhand von mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbten Augenschnitten von Schein- oder SARS-CoV-2 IN-infizierten Mäusen. Da die Netzhautdicke als potenzielle Entzündungssignatur gilt22, haben wir die Netzhautdicke nach einer Infektion gemessen, um die Netzhautentzündung zu bestimmen. Im Vergleich zu den in der Scheingruppe beobachteten Ergebnissen wurden bei den mit SARS-CoV-2 infizierten Mäusen Läsionen im Netzhautgewebe beobachtet (Abb. 2a und ergänzende Abb. 4). Die mittlere Netzhautdicke (von der Ganglienzellschicht bis zur äußeren Kernschicht) betrug 46,27 µm in der Scheingruppe und 75,14 µm in der infizierten Gruppe (Abb. 2b). Eine Virusinfektion erhöhte die Netzhautdicke signifikant um das 1,62-fache und führte zu einer erheblichen Ansammlung infiltrierender Entzündungszellen in den Ganglienzellen sowie in den inneren und äußeren Kernschichten. Um die infiltrierenden Immunzellen zu identifizieren, haben wir die Augen mittels Immunfluoreszenzfärbung auf CD3+ T-, CD4+ T- und CD8+ T-Zellen, Makrophagen/entzündliche Monozyten und GR1+ Neutrophile gefärbt (Abb. 2c und ergänzende Abb. 5). In den Augen von SARS-CoV-2-infizierten Mäusen wurden bei 6 dpi höhere T-Zell- und Neutrophilenwerte beobachtet als bei scheininfizierten Mäusen. Darüber hinaus zeigte die Multiplex-Immunanalyse der Augen, einschließlich der Gliedmaßen, bei 6 dpi einen Anstieg der Spiegel entzündungsfördernder Zytokine und Chemokine, einschließlich Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) und Interferon-Gamma-induzierbares Protein-10 (IP-10), MKC, Monozyten-Chemoattraktionsprotein-1 (MCP-1), Makrophagen-inflammatorisches Protein-2 (MIP-2), Interleukin (IL)−6 und IL-12 als Reaktion auf die Infektion (Abb. 3a). Die Spiegel an entzündungsfördernden Zytokinen und Chemokinen waren im Gehirn im Vergleich zur Lunge deutlich erhöht, wo die Viruslast mit der in den Augen, einschließlich Anhängseln, vergleichbar war (Abb. 1e und ergänzende Abb. 6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IN-verabreichtes SARS-CoV-2 die Netzhautentzündung und die Produktion entzündungsfördernder Zytokine und Chemokine in den Augen von K18-hACE2-Mäusen fördert.

eine H&E-Färbung der Augenabschnitte von K18-hACE2-Mäusen sechs Tage nach einer Scheininfektion oder SARS-CoV-2-Infektion (104 PFU). Repräsentative histologische Bilder (n = 4 pro Gruppe) zeigen Veränderungen in der Netzhautdicke. Maßstabsbalken = 50 μm. b Die Netzhautdicke (n = 4 pro Gruppe, insgesamt acht Augen) wurde gemessen und in einem Balkendiagramm dargestellt (Mock, Grau; SARS-CoV-2, Rot). Symbole stellen Mittelwerte ± SEM dar. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests ermittelt. c Immunfluoreszenzanalyse von Augengewebe von SARS-CoV-2-infizierten Mäusen (Schein, n = 8; SARS-CoV-2, n = 10) bei 6 dpi. Kryoschnitte wurden für Gr-1 (Neutrophile), CD3 (T-Zellen) und DAPI (Kern) markiert. Die Unterschiede in der Infiltration von Gr-1-Neutrophilen und CD3+ T-Zellen zwischen Schein- und SARS-CoV-2-infizierten Mäusen sind in den Bildern dargestellt. Die konfokalen Mikroskopiebilder wurden mit einem 20-fach- und 40-fach-Objektiv (mit 2-fachem Zoom) aufgenommen. Maßstabsbalken im Panel = 100 µm für 20×-Objektiv; 20 µm für 40× (mit 2× Zoom) Objektiv. Die Daten waren repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. SARS-CoV-2 schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2, GCL-Ganglienzellschicht, innere plexiforme IPL-Schicht, innere plexiforme INL-Schicht, äußere plexiforme OPL-Schicht, ONL äußere-nukleäre Schicht, innere IS-Segmente, äußere OS-Segmente, dpi Tage nach Infektion.

a Die Chemokin- und Zytokinspiegel in den Augen, einschließlich Anhängseln, bei SARS-CoV-2-infizierten Mäusen wurden mithilfe einer Multiplex-Immunanalyse gemessen (n = 4 pro angegebenem dpi; 0 dpi, grau; 3 dpi, gelb; 6 dpi). , Rot). G-CSF-Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, IP-10-CXC-Motiv-Chemokin 10 (CXCL10), MKC-Maus-Keratinozyten-abgeleitetes Chemokin, MCP-1-Monozyten-Chemoattraktionsprotein-1 (CCL2), MIP-2-Makrophagen-inflammatorisches Protein-2 (CXCL2). b Foto des in dieser Studie verwendeten visuellen Klippenapparats. c, d Die Latenzzeit bis zum Abstieg von der Plattform (c) und der Prozentsatz der Mäuse, die den ersten Schritt über die Klippenseite machten (d), wurden gemessen (Mock, n = 9; SARS-CoV-2 (Normal), n = 7). ; SARS-CoV-2 (Augensymptome), n = 7). Symbole stellen Mittelwerte ± SEM dar. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe der einfaktoriellen ANOVA (a, c) ermittelt. SARS-CoV-2 schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2, dpi Tage nach der Infektion.

Als nächstes untersuchten wir die funktionellen Folgen einer Netzhautentzündung auf das Sehverhalten. Die angeborene Abneigung gegen die Tiefe wurde im visuellen Klippentest ausgenutzt, um die Tiefenwahrnehmung bei Mäusen mithilfe eines in Abb. 3b23 gezeigten visuellen Klippenapparats zu untersuchen. Die Testreihenfolge war zufällig und jede Maus wurde nur einmal im Leben getestet, um einen Memory-Effekt zu vermeiden. Bei 5 dpi wurden die mit SARS-CoV-2 infizierten Mäuse basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen von Augensymptomen in zwei Gruppen eingeteilt. Am selben Tag stiegen die Mäuse der Schein- und SARS-CoV-2-infizierten Gruppen innerhalb von 4,28 bzw. 3,56 s (Mittelwert) von der Plattform ab (Abb. 3c). Die SARS-CoV-2-infizierten Mäuse mit Augensymptomen zeigten eine längere Latenzzeit für den Abstieg (42,92 s). Die Anzahl der Mäuse mit dem ersten Fuß auf der Klippenseite unterschied sich jedoch unabhängig von den Augensymptomen nicht zwischen Schein- und SARS-CoV-2-infizierten Gruppen (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass die durch die Virusinfektion verursachte Netzhautentzündung die Netzhauterkrankung nicht verschlimmerte Degeneration oder Sehverlust.

Ähnlich wie bei anderen neurotropen Viren wie ZIKV und West-Nil-Viren wurde berichtet, dass SARS-CoV und SARS-CoV-2 bei Patienten Symptome neurologischer Störungen verursachen24,25. Kürzlich wurden bei Patienten mit COVID-19 Hinweise auf eine schnelle Ausbreitung von SARS-CoV-2 über Riechnerven in den Riechkolben gefunden26,27. Da sowohl der Riechnerv als auch der TN anatomische Verbindungen zwischen dem Gehirn und den Nasengängen herstellen28, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass sich IN-verabreichtes SARS-CoV-2 über den TN und den ON auf das Gehirn und die Augen ausbreitet (Abb. 4a). Um diese Hypothese zu validieren, infizierten wir Mäuse über verschiedene Injektionswege mit SARS-CoV-2 (Abb. 4b; IT: intratracheal, IC: intrazerebral, ED: Augentropfen, IV: intravenös). Den Mäusen wurde eine Dosis von 104 PFU injiziert und die Viruslast in Lunge, Gehirn, Augapfel, TN und ON bei 3 und 6 dpi bestimmt. Bei Mäusen, denen die Injektionen über den IN-, IT- und IC-Weg verabreicht wurden, wurde insgesamt ein Gewichtsverlust beobachtet. Mortalität wurde nur bei Mäusen beobachtet, denen über den IC-Weg ab 2 dpi injiziert wurde (ergänzende Abbildung 7). Diese Beobachtung steht im Einklang mit der einer früheren Studie, die zeigte, dass eine Gehirninfektion mit SARS-CoV zum Tod von K18-hACE2-Mäusen führt29. Die IN-Injektion führte zu einem Augentropismus mit erhöhten viralen RNA-Spiegeln in den Augenbulben zwischen 3 und 6 dpi (Abb. 4c). Im Allgemeinen waren die im TN und ON nachgewiesenen viralen RNA-Titer mit denen im Gehirn und im Augapfel vergleichbar, was auf eine Virusübertragung auf die Augen und das Gehirn über eine neuronale Invasion dieser Nerven hindeutet. Wir entdeckten auch infektiöse Viruspartikel im TN und ON, deren Muster dem der viralen RNA-Spiegel ähnelte (ergänzende Abbildung 8). Um diese Ausbreitung von der Lunge in die Augen und das Gehirn weiter zu untersuchen, haben wir das Virus über den IT-Weg direkt in die Lunge injiziert. Ähnlich wie bei einer IN-Infektion wurden auch in den Augäpfeln, im Gehirn, im TN und im ON bei 6 dpi erhöhte virale RNA-Titer festgestellt, was auf eine Virusübertragung von der Lunge auf die Augen und das Gehirn über TN und ON hinweist. Um den Infektionsweg zwischen Augen und Gehirn über TN und ON zu bestätigen, haben wir das Virus über den IC-Weg direkt in das Gehirn injiziert. Virale RNA-Kopien wurden im Augapfel, im Gehirn, in TN und ON gefunden; Allerdings waren die Kopien der viralen RNA in der Lunge relativ geringer als in anderen Geweben. Eine IC-Infektion zeigte offenbar, dass das Virus über TN und ON vom Gehirn in die Augen wandern kann. Da sowohl IN- als auch IC-Infektionen bei 6 dpi den höchsten Virustiter in den Augen aufwiesen, wurden Tränenfluss und Augenausfluss nur bei Mäusen festgestellt, die über den IN- und IC-Weg infiziert wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Virusübertragung zwischen Gehirn und Augen über TN und ON erfolgt, wobei ein Netzwerk die Lunge erreicht.

a Eine anatomische Grafik, die das Gehirn, das Auge (Sehnerv), den Trigeminusnerv und die Lunge einer Maus darstellt. Erstellt mit BioRender.com. b Abbildung, die die verschiedenen Injektionswege zeigt: intranasale (IN), intratracheale (IT), intrazerebrale (IC), Augentropfen- (ED) und intravenöse (IV) Wege. Erstellt mit BioRender.com. c K18-hACE2-Mäuse wurden mit 104 PFU SARS-CoV-2 über fünf verschiedene Injektionswege geimpft (n = 8 pro Injektionsweg; n = 4 für 3 dpi bzw. 6 dpi). Die viralen RNA-Spiegel in Lunge, Gehirn, Bulbus, Trigeminusnerv und Sehnerv wurden bei 3 und 6 dpi mittels RT-qPCR (3 dpi, blau; 6 dpi, rot) analysiert. Virale RNA-Kopien wurden einem Cut-off von 103 Kopien/μg unterzogen. Symbole stellen Mittelwerte ± SEM dar. SARS-CoV-2 schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2, PFU Plaque-bildende Einheit; dpi: Tage nach der Infektion.

Die Augenoberfläche menschlicher12,14 und muriner Modelle30, die ACE2 und TMPRSS2 exprimiert, gilt als zusätzliche Schleimhautoberfläche, die möglicherweise virushaltigen Aerosolen ausgesetzt ist. Um zu untersuchen, ob das Virus in die Augen gelangen und in die Atemwege wandern kann, haben wir die Viruslast nach dem ED-Infektionsweg gemessen (Dosis von 104 PFU). Die virale RNA-Last wurde in den Augapfeln bei 3 dpi, jedoch nicht bei 6 dpi nachgewiesen, und eine niedrige Viruslast wurde nur im TN und ON festgestellt. Dies zeigte die schwache Möglichkeit einer Augenanfälligkeit für SARS-CoV-2. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass eine SARS-CoV-2-Infektion über den intravenösen Weg für eine Lungeninfektion nicht erforderlich ist31. Tatsächlich führte die IV-Infektion zu relativ geringen Viruskopien in allen untersuchten Geweben, darunter Lunge, Gehirn, Augapfel, TN und ON. Insgesamt kann SARS-CoV-2 über TN und ON von den Atemwegen über das Gehirn in die Augen wandern, was nicht rückgängig gemacht werden kann.

Der Einbau eines fluoreszierenden Reportergens in ein replikationskompetentes Virus hat unsere Fähigkeit erweitert, Virusinfektionen und Tropismus in vivo zu verfolgen. Um die Virusausbreitung von den Atemwegen über das Gehirn in die Augen zu bestätigen, verwendeten wir einen infektiösen Klon, SARS-CoV-2-mCherry, der mithilfe des Reverse-Genetics-Systems erzeugt wurde32. Eine für den mCherry-Fluoreszenzmarker kodierende Sequenz wurde im Leserahmen nach dem C-Terminus des ORF7a-Proteins eingefügt, um die Deletion viraler Sequenzen zu vermeiden. Dieses Virus kann Merkmale schwerer COVID-19-Infektionen im Zusammenhang mit dem Mausmodell reproduzieren und rekapitulieren33. Bei Mäusen, die über den IN-Weg mit 104 PFU SARS-CoV-2-mCherry infiziert wurden, wurde ab 5 dpi eine signifikante Morbidität beobachtet (Abb. 5a). Die Mortalität wurde bei 7 dpi bis 9 dpi beobachtet (Abb. 5b). Die übrigen Mäuse erfüllten die humanen Endpunktkriterien bei 9 dpi. Die Virusverteilung in Geweben, einschließlich Lunge, Gehirn, Augapfel, Milz, TN und ON, wurde mit 6 dpi mithilfe eines In-vivo-Bildgebungssystems analysiert, um die Fluoreszenz von SARS-CoV-2-mCherry nachzuweisen. Um die Fluoreszenz im TN und ON von eingeschläferten Mäusen zu erkennen, schneiden wir den Scheitelknochen entlang der linken und rechten Seite und der Sagittalnaht durch und entfernen anschließend vorsichtig das Gehirn, um die Basis der Schädelhöhle freizulegen (Abb. 5c). . In jedem untersuchten Gewebe wurden robuste Fluoreszenzsignale festgestellt (im Bereich von 106 bis 109 Strahlungseffizienz [p/s/cm2/sr]/[μW/cm2]), die sich deutlich von denen der Scheingruppe unterschieden, mit Ausnahme derjenigen in der Milz, die Negativkontrolle (Abb. 5d). Die Virusverteilung im Gehirn und in den Augen bestätigte die neuronale Invasion des Virus in den TN und ON, die für die Übertragung von SARS-CoV-2 genutzt werden kann.

K18-hACE2-Mäuse wurden mit 104 PFU SARS-CoV-2-mCherry IN-geimpft (n = 6 für die scheininfizierten bzw. infizierten Mäuse). a, b Körpergewicht (a) und Überleben (b) wurden mit dem angegebenen dpi überwacht (Mock, grau; SARS-CoV-2-mCherry, rot). Symbole stellen Mittelwerte ± SEM dar. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe mehrerer zweiseitiger T-Tests ermittelt. c Eine gehirnsezierte Rückenansicht der Schädelhöhle der Maus mit Sehnerven, Sehnervenkreuz, Trigeminusganglien und Trigeminusästen (1, Augenhöhle; 2, Oberkiefer; 3, Unterkiefer). Erstellt mit BioRender.com. d Repräsentative In-vivo-Fluoreszenzbilder von Organen, einschließlich Lunge, Gehirn, Augen und Milz, bei scheininfizierten oder SARS-CoV-2-mCherry-infizierten Mäusen bei 6 dpi (n = 5 für die scheininfizierten bzw. infizierten Mäuse; oben, Schein; unten, SARS-CoV-2-mCherry) wurden mittels sequenzieller Bildgebung erfasst. Farbbalken geben die Strahlungseffizienz [p/s/cm2/sr]/[μW/cm2] an. SARS-CoV-2 schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2, PFU Plaque-bildende Einheit; dpi: Tage nach der Infektion.

Da die Expression und Verteilung von hACE2 in K18-hACE2-Mäusen unter der Kontrolle des Cytokeratin-18-Promotors34 steht, sind diese Tiere von Natur aus nicht empfindlich gegenüber einer SARS-CoV-2-Infektion. Die Untersuchung des Augentropismus bei Wildtyp-Syrischen Hamstern, deren endogenes ACE2 mit SARS-CoV-2 interagieren kann, um es auf natürliche Weise für Virusinfektionen empfänglich zu machen35,36,37,38, muss auf den Menschen übertragen werden. Die SARS-CoV-2 IN-Inokulation (Dosis von 104 PFU) von syrischen Hamstern führte zu einem Gewichtsverlust (~10 %) bei 6 dpi, obwohl die meisten Tiere bei 14 dpi wieder ihr ursprüngliches Gewicht erreichten (Abb. 6a). Im Verlauf der Experimente wurde weder in der Schein- noch in der Infektionsgruppe eine Mortalität beobachtet. Um den Augentropismus von SARS-CoV-2 in einem Hamstermodell zu bestimmen, haben wir das Virus über IN- und ED-Wege infiziert. Im Vergleich zu dem, was bei einer IN-Infektion beobachtet wurde, wurde bei ED-infizierten (Dosis von 104 PFU) Hamstern kein signifikanter Gewichtsverlust beobachtet (Abb. 6b). Die Menge an infektiösem SARS-CoV-2 in der Lunge und den Augenhöhlen 6 Tage nach der IN- oder ED-Infektion wurde mittels Plaque-Assay bestimmt. Bei den IN-infizierten Hamstern wurde ein infektiöses Virus in den Augäpfeln nachgewiesen, was den Augentropismus von SARS-CoV-2 bei Wildtyp-Tieren bestätigt (Abb. 6c, d). Darüber hinaus zeigte die Analyse des Virustiters mittels RT-qPCR, dass das Virus in anderen Geweben von IN-infizierten Hamstern, einschließlich Gehirn, ON und TN, mit höheren Titern als in der Milz vorhanden ist, die vernachlässigbar anfällig für SARS-CoV ist -2-Infektion (Abb. 6e). Allerdings wurden geringfügig höhere virale RNA-Spiegel nur in den Augäpfeln und im ON von ED-infizierten Hamstern festgestellt als in der Milz (Abb. 6f). Folglich ergab die Analyse der groben Pathologie pathologische Läsionen und eine Lungenstauung nur bei mit IN-SARS-CoV-2 infizierten Hamstern bei 6 dpi (Abb. 7a). Histopathologische Veränderungen wie eine Verdickung des Alveolarseptums und die Infiltration von Entzündungszellen in die Lunge wurden ebenfalls nur bei IN-SARS-CoV-2-infizierten Hamstern beobachtet (Abb. 7B). Diese Daten stimmen mit den oben genannten Ergebnissen bei K18-hACE2-Mäusen überein und legen nahe, dass sich SARS-CoV-2 über TN und ON von den Atemwegen auf das Gehirn und die Augen ausbreiten kann, was nicht rückgängig gemacht werden kann.

Elf Wochen alte weibliche Goldhamster waren IN-scheininfiziert oder mit 104 PFU SARS-CoV-2 infiziert (n = 6 für scheininfizierte und n = 5 für infizierte Mäuse; Schein, grau; SARS-CoV- 2, rot). a Veränderungen des Körpergewichts werden als Prozentsatz des Ausgangsgewichts beim angegebenen dpi nach einer IN-Infektion angezeigt. b Syrische Hamster waren IN- oder ED-infiziert mit 104 PFU SARS-CoV-2 (jeweils n = 5 für IN-scheininfiziert, IN-infiziert, ED-scheininfiziert und ED-infiziert). Es wird ein Diagramm angezeigt, das die prozentuale Veränderung des Körpergewichts zeigt. c, d Die Viruslast bei 6 dpi in der Lunge und den Augen von IN-infizierten (c) und ED-infizierten (d) Hamstern wurde mittels Plaque-Assay gemessen. e, f Virale RNA-Spiegel bei 6 dpi in der Lunge, im Gehirn, im Augapfel, im Sehnerv (ON), im Trigeminus (TN) und in der Milz von IN-infizierten (e) und ED-infizierten (f) Tieren wurden mittels RT beurteilt -qPCR. Für virale RNA-Kopien wurde ein Grenzwert von 104 Kopien/μg festgelegt. Die gestrichelte Linie zeigt die viralen RNA-Spiegel der Milz als Nachweisgrenze an. Symbole repräsentieren Mittelwerte ± SEMs. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe mehrerer zweiseitiger t-Tests (a, b), eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests (c, d) oder einer einfaktoriellen ANOVA (e, f) ermittelt. SARS-CoV-2 schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2, PFU-Plaque-bildende Einheit, dpi Tage nach der Infektion.

Syrische Hamster waren IN- oder ED-infiziert mit 104 PFU SARS-CoV-2 (jeweils n = 5 für IN-scheininfiziert, IN-infiziert, ED-scheininfiziert und ED-infiziert), ein repräsentatives digitales Bild von Lungen von scheininfizierten oder infizierten Hamstern mit 6 dpi. b Repräsentative H&E-gefärbte Lungengewebeschnitte von scheininfizierten oder infizierten Hamstern bei 6 dpi zur Identifizierung histopathologischer Veränderungen. Die linken Felder stellen Bilder mit geringer Vergrößerung dar (Maßstabsbalken = 500 μm). Die rechten Felder zeigen stark vergrößerte Bilder der durch Quadrate gekennzeichneten Bereiche (Maßstabsbalken = 100 μm).

Eine frühere Studie hat den Neurotropismus von SARS-CoV-2 hervorgehoben und die Notwendigkeit nahegelegt, den Weg der Virusinvasion in das Gehirn zu identifizieren39. Riechnerven bilden Bündel, die eine anatomische Verbindung zwischen dem Gehirn und dem Nasengang durch die Foramina in der Lamellenplatte und die Synapse an den Glomeruli im Bulbus olfactorius herstellen40. Darüber hinaus innervieren die Zweige V1 (ophthalmisch) und V2 (Oberkiefer) des TN (Abb. 5c) sowohl die Atmungs- als auch die Geruchsregion des Nasengangs und verbinden das Gehirn41,42. Obwohl die SARS-CoV-2-Infektion und -Übertragung über die Riechnerven von mehreren Forschungsgruppen26,27,43 nachgewiesen wurde, muss die Frage bei TN noch geklärt werden. Basierend auf Daten eines Patienten mit COVID-19, der an Trigeminusneuralgie litt, wurde eine neuronale Invasion über TN beim Menschen vermutet44. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass TN mit SARS-CoV-2 infiziert werden und zusammen mit ON zur Übertragung des Virus auf Gehirn und Augen genutzt werden kann.

Da der Tränennasengang eine anatomische Verbindung zwischen der Augenoberfläche und den Atemwegen herstellt45, könnte die Ausbreitung des Virus auf die Augen über den Tränennasengang und nicht über die Neuronen erfolgt sein. Obwohl wir eine IT-Infektion nutzten, um eine frühzeitige Übertragung auf die Augen über den Tränennasengang zu verhindern (Abb. 4), können Nachkommenviren nach der Inokulation nach der Virusreplikation in der Lunge über den Tränennasengang in die Augen wandern, was hier jedoch nicht untersucht wurde Studie. Weitere Studien zur Virusreplikation in den oberen Atemwegen unter Bedingungen, die eine Ausbreitung auf die Augen über den Tränennasengang verhindern, sind erforderlich.

Eine kürzlich durchgeführte klinische Studie ergab, dass Patienten mit COVID-19 in beiden Augen Läsionen an der Ganglienzellschicht und der inneren plexiformen Schicht aufwiesen46. Darüber hinaus wurde in einer anderen klinischen Studie berichtet, dass die Patienten flammenförmige Blutungen entlang der Netzhautgefäßarkaden und periphere Netzhautblutungen aufwiesen47. Der Zusammenbruch der Blut-Netzhaut-Schranke kann infolge einer Zunahme der Netzhautdicke zu einer Infiltration von Immunzellen und einer abnormalen Flüssigkeitsansammlung in der Netzhaut führen48. In dieser Studie haben wir die Infiltration von Immunzellen in der inneren Kernschicht und der Ganglienzellschicht beobachtet, es gab jedoch auch einen deutlichen Anstieg der äußeren Kernschicht zusammen mit einer allgemeinen Zunahme der Netzhautdicke bei mit SARS-CoV-2 IN infizierten Mäusen ( Abb. 2a, c und ergänzende Abb. 5). Die Zunahmen in den benachbarten Netzhautschichten können auf die Ansammlung von extrazellulärer Flüssigkeit zurückzuführen sein, die aus dem Zusammenbruch der Blut-Netzhaut-Schranke im tiefen Gefäßplexus der Netzhaut resultiert49. Wir gehen daher davon aus, dass sowohl eine abnormale Flüssigkeitsansammlung in der Netzhaut als auch die Infiltration von Immunzellen an der Zunahme der Netzhautdicke nach einer SARS-CoV-2-Infektion in diesem Tiermodell beteiligt sein könnten.

Eine Netzhautentzündung, die auf der Grundlage einer Retinitis diagnostiziert wird, kann nach der direkten oder indirekten Invasion von Krankheitserregern wie dem Cytomegalievirus50, dem Chikungunyavirus51 und dem West-Nil-Virus52 auftreten. Wenn die Retinitis die Fovea oder den Sehnerv betrifft, kann sie sich verschlimmern und zu einer Einschränkung oder einem Verlust des Sehvermögens führen53. Darüber hinaus war verschwommenes Sehen eines der häufigsten Augensymptome bei Patienten mit COVID-192. Daher haben wir den visuellen Cliff-Test gewählt, der in einer BSL-3-Einrichtung einfach durchzuführen ist, um die Verringerung oder den Verlust des Sehvermögens von SARS-CoV-2-infizierten Mäusen mit Augensymptomen (Abb. 3b–d) zu beurteilen funktionelle Folgen einer Netzhautentzündung. Obwohl sich die Anzahl der Mäuse mit dem ersten Fuß auf der Klippenseite nicht veränderte, erhöhte sich die Latenz zum Absteigen bei den infizierten Mäusen mit Augensymptomen. Wir glauben, dass dies auf die verschwommene Sicht aufgrund von Augenausfluss zurückzuführen sein könnte. Trotz der erhöhten Latenz konnten die Mäuse die Klippe immer noch sehen und sich zur sicheren Bankseite bewegen.

Angesichts der Tatsache, dass Virusinfektionen, einschließlich der durch SARS-CoV-2 verursachten, beim Menschen Augenmanifestationen hervorrufen können, haben mehrere Studien die Ausbreitung von Viren auf Augengewebe untersucht. Influenzaviren des H7-Subtyps zeigen einen Augentropismus und nutzen die Augen als Eintrittsweg, was durch die Verabreichung des Virus auf die Hornhautoberfläche bei Frettchen bestätigt wurde54. Obwohl Imai et al. Als Forscher eine Kombination aus IN- und Augenweg zur SARS-CoV-2-Impfung einführten, entdeckten sie ein infektiöses Virus im Augenlidgewebe von syrischen Hamstern36. In dieser Studie untersuchten wir die Verbreitung von SARS-CoV-2 im Augengewebe nach einer IN-Infektion und beurteilten, ob der Infektionsweg durch die Verabreichung des Virus in die Augen umgekehrt werden kann. Unsere Daten deuten auf eine Unidirektionalität des Infektionswegs von der Lunge zu den Augen in diesen Tiermodellen hin, in denen ACE2 in der Hornhaut der Augen exprimiert wurde (Ergänzende Abbildungen 9, 10). Insbesondere die Viruslast der Augäpfel war vergleichsweise gering und verschwand mit der Zeit, was auf das Fehlen einer Virusproliferation in den Augen hindeutet (Abb. 4c). In den Augen syrischer Hamster wurden nach einer ED-Infektion bei 6 dpi keine infektiösen Viruspartikel nachgewiesen (Abb. 6d). Die Langzeitanalyse der viralen RNA-Spiegel nach einer ED-Infektion in Lunge, Gehirn, Augapfel, TN und ON von K18-hACE2-Mäusen und syrischen Hamstern bei 3, 6, 9 und 12 dpi ergab, dass die niedrige Infektion von TN und ON bei 3 und 6 dpi führte mit der Zeit nicht zu einer Gehirninfektion. Es gab keinen Gewichtsverlust bei ED-infizierten Mäusen bis 18 dpi und bei ED-infizierten Hamstern bis 12 dpi (ergänzende Abbildung 11).

Diese Einseitigkeit des Infektionswegs kann auf die Bildung des Tränenfilms und das Blinzeln zurückzuführen sein. Der Tränenfilm spielt eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem der Augen zum Schutz vor potenziellen Krankheitserregern, einschließlich Lysozym, Lactoferrin, sekretorischem Immunglobulin A und Komplement, das in der Tränendrüse produziert wird55. Es ist bekannt, dass Lysozym Anti-HIV-Aktivität verleiht56. Lactoferrin kann als kationisches Detergens wirken und die Zellmembran einiger Bakterien, Pilze und Viren zerstören57. Sekretorisches Immunglobulin A verhindert möglicherweise die Adhäsion von Krankheitserregern an Wirtszellen, blockiert weitere Virusinfektionen an Schleimhautoberflächen58 und wirkt chemotaktisch auf phagozytische Neutrophile59. Funktionell aktive Komplementfaktoren in Tränen sind an akuten Entzündungsreaktionen beteiligt und tragen zur angeborenen Abwehr gegen Krankheitserreger bei60. Daher könnten antimikrobielle Komponenten im Tränenfilm eine immunologische und schützende Umgebung gegen Virusinfektionen bieten. Darüber hinaus bietet das Blinzeln nicht nur physischen Schutz vor Verunreinigungen von außen, sondern hilft auch beim Abfließen des Tränenfilms aus der Tränenpünktchen61.

Klinische Studien haben gezeigt, dass die für die Augenmanifestation erforderliche Zeit zwischen 15 Tagen und zwei Monaten nach der Infektion oder dem Auftreten der Symptome schwankte8,62. Darüber hinaus haben Colavita et al. entdeckten virale RNA in den Augenabstrichen mit niedrigeren Ct-Werten als in den Nasenabstrichen eines Patienten mit COVID-19, der zwischen 21 und 27 Tagen nach Auftreten der Symptome an Augenmanifestationen litt63. Interessanterweise isolierten sie auch lebende replikationsfähige Viren direkt aus der Augenflüssigkeit, die sie dem Patienten entnommen hatten. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser klinischen Studien wurden IN- und IT-verabreichte Viruskopien in den Augapfeln nachgewiesen, die zeitabhängig zunahmen (Abb. 4c).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Augenmanifestation und die Netzhautentzündung durch die SARS-CoV-2-Infektion im Mausmodell gefördert wurden, was zu einer erhöhten Zytokinproduktion führte. Das Virus breitet sich über ein Netzwerk bestehend aus TN und ON von der Lunge auf das Gehirn und die Augen aus. Dieser Augentropismus wurde auch bei syrischen Wildhamstern beobachtet. Die Auslösung einer Augenentzündung durch eine Virusinfektion der Augen und ihre klinische Relevanz sind jedoch weiterhin unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Neben dem Atmungssystem sollten Augen und TN als SARS-CoV-2-anfällige Organsysteme gelten. Unsere Daten erhöhen das Bewusstsein für durch Augen- und Neuroneninfektionen vermittelte Erkrankungen, die über Atemwegserkrankungen hinausgehen, was bei der Entwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten mit COVID-19 hilfreich sein wird.

Alle Verfahren wurden in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) oder Tier-BSL-3 für SARS-CoV-2-bezogene Experimente und von Personal durchgeführt, das mit elektrisch betriebenen Atemschutzgeräten ausgestattet war.

Acht Wochen alte männliche und weibliche B6.Cg-Tg(K18-hACE2)2Prlmn/J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) gekauft, und 6 bis 7 Wochen alte weibliche K18-hACE2 C57BL /6 Mäuse wurden vom Animal Resource Centre (Perth, Australien) bezogen. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Korea Research Institute of Chemical Technology genehmigt (Protokoll-ID 8A-M6, IACUC-ID 2021-8A-02-01 und 2021-8A-03-03). Immunhistochemische Experimente (Abb. 2c und ergänzende Abb. 2, 5, 10) wurden von der Tierethikkommission der Griffith University (MHIQ/08/21) genehmigt und die Verfahren entsprachen dem Australian National Health and Medical Research Council. Die Mäuse wurden in einem 12:12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 22–24 °C und 40–55 % Luftfeuchtigkeit gehalten und nach Wunsch mit Futter und Wasser versorgt.

Elf Wochen alte weibliche Goldhamster (RjHan:AURA-Stamm) wurden von Janvier Labs (Saint-Berthevin, Frankreich) gekauft. Die Hamster wurden in Standardkäfigen einer Einrichtung der Tierbiosicherheitsstufe 3 (ABL-3) gehalten und einem 12:12-stündigen Licht-/Dunkelzyklus bei 22–24 °C, 40–55 % Luftfeuchtigkeit und entsprechender Futter- und Wasserversorgung ausgesetzt gewünscht. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB-ACE-21329, KRIBB-IBC-20220201) genehmigt.

In dieser Studie galt ein Gewichtsverlust von 25 % als humanes Sterbehilfekriterium durch CO2-Erstickung. Organgewebe wurden mit dem angegebenen dpi gesammelt, nachdem die Tiere mit Ketamin/Xylazin (160 mg/kg Ketamin und 16 mg/kg Xylazin) oder Isofluran in Gegenwart von Sauerstoff in einer Induktionskammer 5 Minuten lang anästhesiert und anschließend mit 10 % Perfusion behandelt wurden ml kaltes PBS, damit das Blut abfließen kann. Die Gewebe wurden in vorbeladenen Stahlperlenröhrchen, die kaltes PBS enthielten, unter Verwendung des TacoPrep Bead Beater (GeneReach Biotechnology Corp., Taichung City, Taiwan) gewogen und homogenisiert.

Der SARS-CoV-2-Stamm (GISAID-Zugangs-ID: EPI_ISL_407193) wurde in Vero-Zellen (CCL-81, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA) vermehrt. Der pCC1-4K-SARS-CoV-2-mCherry-Klon (GenBank-Zugangsnummer MT926411) wurde zur Rettung infektiöser Viren gemäß dem von Referenz entwickelten Protokoll verwendet. 32. Kurz gesagt wurden 3 μg Plasmid-DNA in BHK-21-Zellen (CCL-10, ATCC) in einer Platte mit sechs Vertiefungen unter Verwendung von Lipofectamine LTX mit Plus-Reagenz (15338100, Invitrogen, Waltham, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurde der Überstand in einem T25-Kolben auf Vero-Zellen übertragen. Nach weiterer viertägiger Inkubation wurde das infektiöse Virus mithilfe eines Plaque-Assays titriert.

Für den Plaque-Assay wurde das Virus seriell in Eagles Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt mit 2 % fötalem Rinderserum, verdünnt. Das Kulturmedium wurde von den Vero E6-Zellen in einer 24-Well-Platte (~1 × 105 pro/Well) einen Tag vor dem Assay entfernt und das Inokulum auf dreifache Zellmonoschichten übertragen. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurde das Inokulum entfernt und die infizierten Zellen mit 1,8 % Carboxymethylcellulose in MEM überschichtet. Die Proben wurden vier Tage lang inkubiert, gefolgt von der Fixierung und Färbung mit 0,05 % Kristallviolett, das 1 % Formaldehyd enthielt. Die Plaques wurden mit einer ImmunoSpot-Software und einem Analysegerät der Version 5.0 (Cellular Technology Ltd, Shaker Heights, OH, USA) gezählt und gemessen.

Alle Virusimpfungen (SARS-CoV-2 verdünnt in PBS, eine Dosis von 104 PFU) wurden über IN-, IT-, IC-, ED- und IV-Wege unter Narkose mit Isofluran oder Ketamin/Xylazin (160 mg/kg Ketamin und 16 mg/kg) verabreicht. kg Xylazin) in einer BSL-3-Tierhaltung, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren. IN-, IC- und IV-Injektionen wurden gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll64 durchgeführt. Der Scheingruppe wurde in allen Experimenten das gleiche Volumen PBS injiziert. Das Körpergewicht wurde jeden Tag nach der Infektion gemessen.

Mäuse wurden mit zwanzig Mikroliter Inokulum pro Maus infiziert. Die Maus wurde anästhesiert und das Inokulum wurde tropfenweise in ein Nasenloch verabreicht.

Das Protokoll für die IT-Injektion wurde bereits beschrieben65. Pro Maus wurden 20 Mikroliter der Virussuspension injiziert. Die betäubten Mäuse wurden mit ihren Vorderzähnen auf die Schnur gelegt, wobei ihre Brust senkrecht auf der Plattform hing. Der obere Brustbereich wurde mit Licht hoher Intensität beleuchtet. Der Mund wurde geöffnet und die Zunge mit einer flachen Pinzette herausgezogen, um das weiße Licht aus der Luftröhre zu sehen. Der Katheter wurde in die Luftröhre eingeführt und anschließend die Nadel entfernt. Das Inokulum wurde direkt in die Öffnung des Katheters injiziert. Die IT-Injektion wurde mit einer 2 %igen Lösung von Evans Blue in normaler Kochsalzlösung (E2129, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) geprobt.

Pro anästhesierter Maus wurden zehn Mikroliter des Inokulums injiziert. Vor der Injektion wurde das Inokulum mit einer 30 G × 4 mm ultrafeinen Einwegnadel (0J293, Jeongrim Medical, Chungcheongbuk-do, Republik Korea) in eine Mikroliterspritze aus Glas (80401, Hamilton, Reno, NV, USA) geladen. . Die Injektionsstelle befand sich auf halbem Weg zwischen Augen und Ohren und unmittelbar außerhalb der Mittellinie. Die Nadel wurde verwendet, um direkt und langsam in den Schädel einzudringen. Die Injektion erfolgte sehr langsam und es folgte eine langsame Entfernung, um einen Ausfluss zu verhindern. Die IC-Injektion wurde mit einer 2 %igen Lösung von Evans Blue in normaler Kochsalzlösung geprobt.

Vier Mikroliter des Inokulums wurden ohne Narbenbildung direkt tropfenweise auf die Hornhautoberfläche beider Augen aufgetragen und anschließend die Augenlider massiert.

Pro Maus wurden 50 Mikroliter des Inokulums injiziert. Die Mäuse wurden in die Schwanzzugangs-Nagerhalter gesetzt und das Inokulum wurde langsam mit einer 1-ml-Spritze mit einer 26-G-1/2-Nadel (BD, New Jersey, USA) in die Schwanzvene injiziert.

Die Gesamt-RNA wurde aus Homogenaten mit dem Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit (AS1340, Promega, Madison, WI, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Quantitative RT-PCR (QuantStudio 3, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) wurde unter Verwendung eines einstufigen Prime script III RT-qPCR-Mix (RR600A, Takara, Kyoto, Japan) durchgeführt. Die virale RNA von NP wurde mit einer 2019-nCoV-N1-Sonde (10006770, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) nachgewiesen.

Die Augen von SARS-CoV-2-infizierten Mäusen wurden bei 0, 3 und 6 dpi präpariert und dann in Perlenröhrchen homogenisiert (a-psbt, GeneReach Biotechnology, Taichung, Taiwan). Aliquote wurden mit dem MILLIPLEX-Panel für humane Zytokine/Chemokine-Magnetkügelchen (HCYTOMAG-60K, Merck Millipore, Burlington, MA, USA) und den Luminex 200-Multiplexing-Instrumenten (40-012, Merck Millipore) analysiert, um die Zytokin-/Chemokin-Expression zu beurteilen.

Das Protokoll für Mausaugenschnitte wurde bereits beschrieben66. Die Augen, einschließlich der Gliedmaßen, wurden gesammelt und über Nacht in Davidsons Fixiermittel (BBC Biochemical, Mount Vernon, WA, USA) fixiert. Die fixierten Augen wurden herausgeschnitten, um den Druck auszugleichen und die Morphologie zu bewahren. Anschließend wurden sie routinemäßig verarbeitet und in Paraffinwachs (ASP300S, Leica, Wetzlar, Deutschland) eingebettet. Anschließend wurden die Augen in 7 μm große Netzhautquerschnitte geschnitten und mit H&E (BBC Biochemical) unter Verwendung eines Autostainers (ST5010, Leica) gefärbt. Die Bilder wurden mit einem Olympus BX51-Mikroskop (Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen. Die Netzhautdicke wurde mit der Software Nuance 3.02 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) gemessen.

Es wurden Kryoschnitte und Immunfluoreszenzfärbung67 durchgeführt. K18-hACE2-Mäuse wurden am Tag 6 nach der Infektion durch CO2-Erstickung oder intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin getötet. Die Augen, einschließlich der Gliedmaßen, wurden gesammelt und mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 2 Stunden oder über Nacht fixiert. Nach einer Inkubation über Nacht in 20 % Saccharose oder in 30 % Saccharose für 6 Stunden bei 4 °C wurden sie zur Einbettung in eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) (AGR1180, Agar Scientific, Essex, UK) in eine Kryoform überführt und eingefroren bei −80 °C über Nacht. Zehn Mikrometer große Netzhautquerschnitte, die aus dem gefrorenen OCT-Gewebeblock erhalten wurden, wurden dreimal 5 Minuten lang mit Waschpuffer (0,5 % Tween 20 in PBS) gewaschen, um OCT zu entfernen. Anschließend wurden die Schnitte 1 Stunde lang mit Blockierungspuffer (2 % Rinderserumalbumin (BSA), 10 % normales Ziegenserum in PBS) inkubiert, gefolgt von einer weiteren Inkubation über Nacht bei 4 °C mit Antikörpern gegen Spike-Protein (40150-T62- COV-2, Sino Biological, Peking, China; 1:100), γ-Synuclein (sc-65979 AF488, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA; 1:50), Gr-1 (550291, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA; 1:300), CD3 (100366, BioLegend, San Diego, CA, USA; 1:350), CD4 (550280, BD Biosciences; 1:400), CD8 (550281, BD Biosciences; 1: 400), menschliches ACE2 (ab15348, Abcam, Cambridge, UK; 1:350) und ACE2 (MAB933, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA; 1:100) in Waschpuffer mit 1 % BSA. Nach dem Waschen wurden die primären Antikörper mit Anti-Ratten- oder Anti-Kaninchen-AlexaFluor 488, AlexaFluor 568, AlexaFluor 647 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA; 1:1000), AlexaFluor 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA; 1:1000) oder Streptavidin DyLight650 (Thermo Fisher Scientific). Die Kerne wurden mit DAPI (62247, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gefärbt. Die Objektträger wurden mit dem Antifademittel ProLong Gold (Thermo Fisher) montiert. Immunfluoreszenz wurde mittels konfokaler Mikroskopie (LSM700, Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) beobachtet. Z-Stapel (13 Schichten) wurden abgebildet und zu einer Projektion mit maximaler Intensität zusammengeführt. Einige Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop (Olympus FV3000, Olympus, Tokio, Japan) mit einer Auflösung von 1024 × 1024 unter Verwendung von 20-fach- und 40-fach-Objektiven (mit 2-fachem Zoom) aufgenommen und mit FV31S-DT (in Olympus integrierte Software) verarbeitet.

Basierend auf dem von Ref. entwickelten Protokoll wurde ein visueller Klippentest durchgeführt. 68 mit einigen Modifikationen. Die Mäuse wurden in einer oben offenen Acrylglasbox (40 × 30 × 50 cm) getestet. Die Lichtquelle im Experimentierraum war gedimmt (ca. 20 lx). Die Barrieren waren undurchsichtig, um Reflexionen zu verhindern. Ein Papier mit einem großen schwarz-weißen Karomuster (2 × 2 cm2) wurde unter eine Hälfte der Platte („Bankseite“) gelegt, während die Unterseite der anderen Hälfte („Klippenseite“) mit einem kleinen Karomuster bedeckt war Musterblatt (1 × 1 cm2), um den Klippenabfall hervorzuheben. Die Mäuse wurden auf der schwarzen zentralen Plattform (0,4 × 30 × 0,1 cm) zwischen der Bankseite und der Klippenseite platziert und ihre Aktivitäten wurden 2 Minuten lang aufgezeichnet, um die Latenzzeit beim Absteigen und die Richtung des ersten Fußes auf der Bank zu messen oder Felswände.

Mit SARS-CoV-2-mCherry infizierte Mäuse wurden bei 6 dpi getötet und mit 4 % Paraformaldehyd in PBS perfundiert. Die Lunge, das Gehirn und andere Organe wurden sofort entnommen, um Fluoreszenzsignale zu erkennen. Unter Verwendung des IVIS Lumina S5-Systems (PerkinElmer, Wrentham, MA, USA) wurden die Gewebe nacheinander mit einem festen Emissionsfilter bei 520 nm abgebildet, um die optimale Anregung von 420 bis 480 nm (1 s, Blende = 1, mittel) zu bestimmen Klasseneinteilung). Die Bilder wurden mit der Software Living Image 4.7 (PerkinElmer, Wrentham, MA, USA) analysiert. Die Epifluoreszenz wurde nach Abzug des Hintergrundsignals in Einheiten der Strahlungseffizienz [p/s/cm2/sr]/[μW/cm2] ausgedrückt.

Alle Experimente wurden mindestens zweimal durchgeführt. Alle Daten wurden mit der GraphPad Prism 8.0-Software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) analysiert. Die Daten wurden als Mittelwerte mit dem Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angezeigt. Für Experimente mit nur zwei Gruppen wurde ein ungepaarter zweiseitiger t-Test verwendet. Für Experimente mit drei und mehr Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) verwendet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Spezifische Analysemethoden werden in den Abbildungslegenden beschrieben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle in dieser Studie generierten Quelldaten werden in diesem Artikel bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Research Council of Science & Technology (NST) unterstützt, finanziert von der koreanischen Regierung (MSIP; CRC-16-01-KRICT an Y.-CK), (MSIT; CRC21021, KRIBB KGM5242221 an H. -JK), National Research Foundation of Korea (NRF), finanziert vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Technologie (MSIT) der koreanischen Regierung (2020R1C1C1003379 an Y.-CK) und dem Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Grant (APP1184879 an SM). SM ist Empfänger des NHMRC Senior Research Fellowship (APP1154347).

Hye Jin Shin

Aktuelle Adresse: Abteilung für Mikrobiologie, Chungnam National University School of Medicine, Daejeon, 35015, Republik Korea

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Gi Uk Jeong, Hyung-Jun Kwon.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Suresh Mahalingam, Young-Chan Kwon.

Abteilung für konvergente Forschung zu neu auftretenden Virusinfektionen, Korea Research Institute of Chemical Technology, Daejeon, 34114, Republik Korea

Gi Uk Jeong, Hyun Woo Moon, Gun Young Yoon, Hye Jin Shin, Chonsaeng Kim, Dae-Gyun Ahn, Kyun-Do Kim, Seong-Jun Kim und Young-Chan Kwon

Department of Functional Biomaterial Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Jeongeup, 56212, Republik Korea

Hyung-Jun Kwon, In-Chul Lee und Young Bae Ryu

Zentrum für die Entwicklung neuer Arzneimittel für Haustiere, Zweigstelle Jeonbuk, Korea Institute of Toxicology, Jeongeup, 53212, Republik Korea

Hyung-Jun Kwon & In-Chul Lee

Gruppe für neu auftretende Viren, Entzündungen und Therapeutika, Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australien

Wern Hann Ng, Xiang Liu, Nicholas JC King, Adam Taylor und Suresh Mahalingam

Global Virus Network (GVN) Kompetenzzentrum für Arboviren, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australien

Wern Hann Ng, Xiang Liu, Adam Taylor und Suresh Mahalingam

Fakultät für Pharmazie und medizinische Wissenschaften, Griffith University, Gold Coast, Queensland, Australien

Wern Hann Ng, Xiang Liu, Adam Taylor und Suresh Mahalingam

Viral Immunopathology Laboratory, The Charles Perkins Centre, The University of Sydney, Sydney, NSW, 2006, Australien

Zheng Lung Ling, Alanna G. Spiteri und Nicholas JC King

School of Medical Sciences, Fakultät für Medizin und Gesundheit, The University of Sydney, Sydney, NSW, 2006, Australien

Zheng Lung Ling, Alanna G. Spiteri und Nicholas JC King

Sydney Institute for Infectious Diseases, The University of Sydney, Sydney, NSW, 2006, Australien

Nicholas JC King

Sydney Nano, The University of Sydney, Sydney, NSW, 2006, Australien

Nicholas JC King

Department of Life Sciences, PerkinElmer, Seoul, 08380, Republik Korea

Ji Soo Chae

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GUJ und Y.-CK konzipierten diese Studie und SM, NJCK und Y.-CK überwachten sie. GUJ, H.-JK, SM und Y.-CK haben Experimente entworfen. GUJ, H.-JK, WHN, XL, ZLL, AGS, NJCK, AT, HWM, GYY, H.-JS, I.-CL und D.-GA führten Experimente durch. GUJ, JSC, SM und Y.-CK analysierten Daten. H.-JK, S.-JK, SM und Y.-CK stellten wesentliche Reagenzien zur Verfügung. GUJ, HJ.K., SM und Y.-CK haben das Manuskript geschrieben. SM und Y.-CK sind gemeinsame leitende Autoren. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Young-Chan Kwon.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Eric Song und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Jeong, GU, Kwon, HJ., Ng, WH et al. Augentropismus von SARS-CoV-2 in Tiermodellen mit Netzhautentzündung durch neuronale Invasion nach intranasaler Inokulation. Nat Commun 13, 7675 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35225-1

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Eingegangen: 03. Mai 2022

Angenommen: 22. November 2022

Veröffentlicht: 12. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35225-1

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