Genom

Jul 15, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5326 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Trypanosomatiden, zu denen die wichtigsten Krankheitserreger von Menschen und Nutztieren gehören, sind begeißelte Protozoen, deren Zellzykluskontrolle und die zugrunde liegenden Mechanismen nicht vollständig verstanden sind. Hier beschreiben wir ein genomweites RNA-Interferenz-Bibliotheksscreening auf Zellzyklusdefekte bei Trypanosoma brucei. Wir lösten einen massiven parallelen Knockdown aus, sortierten die gestörte Population mittels Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie, sequenzierten RNAi-Ziele aus jedem Stadium tief und rekonstruierten Zellzyklusprofile auf genomischer Ebene digital; Ermöglicht auch die Datenvisualisierung mithilfe eines Online-Tools (https://tryp-cycle.pages.dev/). Die Analyse mehrerer hundert Gene, die das Fortschreiten des Zellzyklus beeinflussen, zeigt mehr als 100 Flagellenkomponenten-Knockdowns im Zusammenhang mit der Endoreduplikation des Genoms, Hinweise auf eine metabolische Kontrolle des G1-S-Übergangs, Knockdowns von Oberflächenantigen-regulatorischen mRNA-bindenden Proteinen im Zusammenhang mit der G2M-Akkumulation und ein mutmaßliches erforderliches Nukleoredoxin sowohl für die Segregation des mitochondrialen Genoms als auch für die Mitose. Die Ergebnisse liefern umfassende funktionelle genomische Beweise für die bekannten und neuartigen Maschinen, Wege und Regulatoren, die das Fortschreiten des Trypanosomen-Zellzyklus koordinieren.

Der kanonische eukaryotische Zellzyklus umfasst diskrete Phasen: G1 (Lücke 1), wenn sich die Zelle auf die DNA-Replikation vorbereitet; S-Phase (Synthesephase), in der die nukleare DNA-Replikation stattfindet; G2 (Lücke 2), wenn sich die Zelle auf die Mitose vorbereitet; und M (Mitose), wenn die replizierte DNA getrennt wird und sich der Zellkern teilt1. Auf die Mitose folgt die Zytokinese (Zellteilung), wodurch zwei Tochterzellen entstehen2. Ratenbegrenzende Mechanismen, die die Qualitätskontrolle erleichtern, werden an diskreten Punkten entlastet. Daher können Anomalien, die während des Fortschreitens des Zellzyklus auftreten, zu einer Verzögerung oder einem Stillstand des Zellzyklus führen, damit die Zelle die Anomalie beheben kann; beim Zelltod, wenn die Anomalie nicht behoben werden kann, oder unter anderem bei der Karzinogenese. Daher unterliegt das Fortschreiten des Zellzyklus typischerweise einer strengen Kontrollpunktkontrolle; Die Kontrollpunkte G1-S, Intra-S-Phase, G2-M und Spindel kontrollieren den Beginn der S-Phase, das Fortschreiten der S-Phase, den Beginn der M-Phase bzw. das Fortschreiten der M-Phase3. Diese Prozesse wurden eingehend untersucht, insbesondere weil Zellzyklusdefekte häufige Auslöser der Krebsentstehung sind4. Unser Verständnis der Evolution und der Mechanismen der Progressionskontrolle des eukaryotischen Zellzyklus basiert jedoch hauptsächlich auf Studien zu Opisthokonten (einschließlich Tieren und Pilzen), wobei vergleichsweise weniger Studien zu divergenten Eukaryoten wie den Trypanosomatiden1 vorliegen.

Die Trypanosomatiden sind begeißelte Protozoen und umfassen Parasiten, die eine Reihe vernachlässigter Tropenkrankheiten verursachen, die erhebliche Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier haben. Das afrikanische Trypanosom, Trypanosoma brucei, wird durch Tsetsefliegen übertragen und verursacht in Afrika südlich der Sahara sowohl Krankheiten bei Menschen als auch bei Tieren, die Schlafkrankheit bzw. Nagana5. T. brucei hat sich als äußerst kontrollierbares experimentelles System herausgestellt, sowohl als Parasit als auch als Modellorganismus6. Beispielsweise dient das Flagellum von T. brucei7 als Modell für Studien zu menschlichen Ziliopathien8,9,10,11. Zu den abweichenden Merkmalen, die auch andere pathogene Trypanosomatiden wie Trypanosoma cruzi und Leishmania aufweisen, gehören die in Glykosomen unterteilte Glykolyse12, ein einzelnes Mitochondrium mit einer komplexen mitochondrialen DNA-Struktur, die als Kinetoplasten bekannt ist13 und die polycistronische Transkription fast aller Gene14. Die weit verbreitete und konstitutive polycistronische Transkription bei Trypanosomatiden legt großen Wert auf posttranskriptionelle Kontrollen durch mRNA-bindende Proteine ​​(RBPs) und posttranslationale Kontrollen, die beispielsweise die Proteinphosphorylierung umfassen.

Studien, die sich auf die Zellzykluskontrolle bei T. brucei konzentrieren, haben Merkmale aufgedeckt, die bei anderen gut untersuchten Eukaryoten konserviert sind, aber auch abweichende Merkmale13,15. Insbesondere deuten die verfügbaren Beweise darauf hin, dass bestimmte Zellzyklus-Kontrollpunkte fehlen. Beispielsweise kann die Zytokinese im Insektenstadium von T. brucei unabhängig von der Mitose oder der nuklearen DNA-Synthese erfolgen16. Darüber hinaus nutzen Funktionen, von denen bisher angenommen wurde, dass sie von hochkonservierten Proteinen erfüllt werden, linienspezifische oder stark divergierende Proteine ​​in Trypanosomatiden. Der Kinetochorkomplex, der die Chromosomentrennung steuert, ist beispielsweise Trypanosomatid-spezifisch17, während der Ursprungserkennungskomplex (ORC), der an der Initiierung der DNA-Replikation beteiligt ist, stark divergent ist18. In Hochdurchsatzstudien ergab die Überwachung des Transkriptoms19 und des Proteoms20 während des Zellzyklus von T. brucei Hunderte regulierter mRNAs und Proteine, während die phosphoproteomische Analyse die dynamische Phosphorylierung mehrerer RBPs ergab21. Die Divergenz stellt jedoch erhebliche Herausforderungen dar, da vielen T. brucei-Genen noch keine spezifische Funktion zugewiesen wurde und viele Zellzyklusregulatoren wahrscheinlich noch identifiziert werden müssen. Funktionelle genetische Screenings im Genommaßstab mit hohem Durchsatz können verwendet werden, um jedes Gen in einem Genom gleichzeitig auf seine Rolle in einem bestimmten Prozess zu untersuchen. Wir haben die RNA-Interferenzzielsequenzierung (RIT-seq) für T. brucei22 entwickelt und zuvor Fitnessprofile im Genommaßstab erstellt, um Essentialitätsvorhersagen und die Priorisierung potenzieller Arzneimittelziele zu erleichtern23.

Hier beschreiben wir ein RIT-seq-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung von Zellzykluskontrollen und -regulatoren im Blutkreislauf afrikanischer Trypanosomen. Nach der Induktion des Knockdowns wurden die Zellen mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) nach ihrem DNA-Gehalt sortiert. Bei den sortierten Populationen handelte es sich um die Stadien des G1-, S- und G2M-Zellzyklus sowie um gestörte Zellpopulationen mit entweder weniger DNA als normalerweise in G1 oder mehr DNA als normalerweise in G2M gefunden. Für jede sortierte Population wurde eine RIT-seq-Analyse durchgeführt und Zellzyklusprofile wurden für jeden Knockdown mithilfe von Sequenzierungs-Lesezählungen digital rekonstruiert. Dieses genomweite Screening deckt die Proteinkomplexe, Signalwege und Signalfaktoren auf, die für fortschreitende Schritte durch den Trypanosomen-Zellzyklus erforderlich sind. Beispielsweise wurde gezeigt, dass glykolytische Enzyme für die G1/S-Progression erforderlich sind, CMG-Komplexkomponenten (Cdc45-MCM-GINS) für die DNA-Replikation erforderlich sind, Proteasom- und Kinetochor-Komplexkomponenten für die G2M-Progression erforderlich sind, und Es wurde gezeigt, dass Flagellenkomponenten sowie Zytokinese-Initiationsfaktoren für die Zytokinese erforderlich sind. Zwei Treffer wurden zur weiteren Validierung ausgewählt, von denen sich gezeigt hat, dass es sich bei einem davon um ein durch den Zellzyklus reguliertes mutmaßliches Nukleoredoxin handelt, das an der Koordinierung der Segregation des mitochondrialen Kinetoplasten und des Kerngenoms beteiligt ist.

Blutform T. brucei lässt sich leicht in Zellkulturen züchten, mit exponentieller Proliferation und einer Verdoppelungszeit von etwa 6,5 ​​Stunden. Das Kerngenom von T. brucei ist typischerweise diploid, so dass G1-Zellen einen Genomgehalt von 2 C haben; C steht für den haploiden DNA-Gehalt. Zellen, die die nukleare S-Phase durchlaufen und ihre DNA replizieren, haben einen Genomgehalt zwischen 2 C und 4 C, während Zellen, die die DNA-Replikation abgeschlossen haben (G2M), einen DNA-Gehalt von 4 C haben (Abb. 1a). Durch Mitose und Zytokinese entstehen dann zwei Tochterzellen mit einem 2-C-DNA-Gehalt. Einige Störungen führen zu Defekten, die einen „Kurzschluss“ mit sich bringen, wobei S-Phase, Mitose und/oder Zytokinese übersprungen werden und Sub-2C-Zellen oder überreplizierte, polyploide (>4 C) Zellen entstehen (Abb. 1a). Polyploide Zellen entstehen durch Endoreduplikation, zusätzliche Runden der DNA-Replikation ohne Zytokinese, entweder mit24 oder ohne25,26 Mitose, wodurch Zellen mit mehreren Kernen bzw. mit polyploiden Kernen entstehen.

a Schematische Darstellung des Blutkreislaufs von T. brucei, die auch abweichende Phänotypen unter 2C und >4 C (mehrere Kerne) zeigt; Anukleare Zoide werden nicht angezeigt, da sie mit RIT-seq nicht nachweisbar sind. b Das Schema zeigt den RIT-seq-Bildschirm; Massive parallele Induktion von RNAi mit Tetracyclin (Tet), gefolgt von Durchflusszytometrie und RIT-seq, was die Rekonstruktion von Zellzyklusprofilen unter Verwendung kartierter Messwerte aus jedem Knockdown ermöglicht. Jedes Read-Mapping-Profil umfasst das interessierende Gen und zugehörige nicht translatierte Regionen, die in der zugehörigen mRNA vorhanden sind. Die Bibliotheksdaten repräsentieren die nichtinduzierte und unsortierte Population. GeneIDs, zum Beispiel Tb927.7.3160, werden ohne das gemeinsame „Tb927“ angegeben. Komponente.

Wir haben einen Hochdurchsatz-RNA-Interferenz (RNAi)-Zielsequenzierungs-Screen (RIT-seq) entwickelt, um Zellzykluskontrollen und -regulatoren auf genomischer Ebene zu identifizieren. Zu den Hauptmerkmalen des RIT-seq-Screenings gehören: erstens die Verwendung einer hochkomplexen T. brucei-RNAi-Bibliothek, die in diesem Fall etwa eine Million Klone umfasst; zweitens massive parallele Tetracyclin-induzierbare Expression verwandter dsRNA; und drittens eine umfassende Sequenzierung, Kartierung und Zählung kartierter Lesevorgänge, die von RNAi-Zielfragmenten abgeleitet sind22. Jeder Klon in der Bibliothek verfügt über eines von etwa 100.000 verschiedenen RNAi-Zielfragmenten (250–1500 bp) zwischen Kopf-an-Kopf-induzierbaren T7-Phagen-Promotoren. Dies wird erreicht, indem jede Kassette auf einen bestimmten, einzelnen chromosomalen Locus ausgerichtet wird, der eine robuste und reproduzierbare induzierbare Expression unterstützt22,27. Induzierbar exprimierte lange dsRNA wird dann von der nativen RNAi-Maschinerie zu siRNA verarbeitet28. Komplexität und Tiefe der Genomabdeckung in der Bibliothek sind von entscheidender Bedeutung, da ähnliche Phänotypen, die von mehreren Klonen mit unterschiedlichen RNAi-Zielfragmenten gegen dasselbe Gen erzeugt werden, eine Kreuzvalidierung ermöglichen. Verbesserungen bei der Annotation des Referenzgenoms29, der Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation und den Tools zur Analyse von Sequenzdaten (siehe Methoden) haben auch die quantitative Phänotypanalyse mithilfe von Short-Read-Sequenzdaten erheblich erleichtert.

Kurz gesagt, wir induzierten 24 Stunden lang einen massiven parallelen Knockdown in einer asynchronen T. brucei-Blutstrom-RNAi-Bibliothek, fixierten die Zellen, färbten ihre DNA mit Propidiumiodid (PI) und verwendeten dann fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um die gestörte Zelle zu teilen Bevölkerung in; subdiploide (<2 C), G1 (2 C), S (zwischen 2 C und 4 C), G2M (4 C) und überreplizierte (> 4 C) Pools (ergänzende Abbildung 1). Fixierung und Färbung mit dem fluoreszierenden DNA-Interkalationsfarbstoff wurden für die Hochdurchsatzsortierung voroptimiert (siehe Materialien und Methoden). Ungefähr 10 Millionen Zellen wurden für jeden der G1-, S- und G2M-Pools gesammelt und Proben aus diesen Pools wurden nach dem Sortieren überprüft, um ihre Reinheit zu bestimmen (Abb. 1b, ergänzende Abb. 1). Für die gestörten und weniger häufig vorkommenden <2 C- und >4 C-Pools wurden weniger als eine Million Zellen gesammelt; Diese Pools wurden vollständig für die RIT-seq-Analyse aufbewahrt.

RIT-seq wurde sowohl für die nicht induzierten als auch für die induzierten, unsortierten Bibliothekskontrollen und für jeden der fünf induzierten und sortierten Zellpools durchgeführt, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Kurz gesagt, wir extrahierten genomische DNA aus jeder Probe, amplifizierten DNA-Fragmente, die jedes RNAi-Zielfragment enthielten, in PCR-Reaktionen (ergänzende Abbildung 1) und verwendeten die amplifizierten Produkte, um Illumina-Sequenzierungsbibliotheken zu erstellen. Die Analyse der auf das Referenzgenom abgebildeten Sequenzierungs-Reads ergab Zählungen sowohl für die Gesamt-Reads als auch für Reads, die den Barcode (GTGAGGCCTCGCGA) enthielten, der jedes RNAi-Zielfragment flankiert; Das Vorhandensein des Barcodes bestätigte, dass die Lesevorgänge von einem bestimmten RNAi-Zielfragment und nicht von einer anderen Stelle im Genom stammten. Wir ermittelten die Anzahl der Lesevorgänge, die jeder von >7200 nicht-redundanten Gensequenzen in den nicht-induzierten und induzierten, unsortierten Bibliothekskontrollen und in jeder der fünf sortierten Proben zugeordnet wurden. Für die aktuelle Analyse haben wir den 24-Stunden-Zeitpunkt ausgewählt, der etwa 3,5 Populationsverdopplungszeiten entspricht. Wir fanden heraus, dass die Messwerte für 23,4 % der Gene nach 72 Stunden Knockdown in unserer vorherigen RIT-seq-Studie um das > Dreifache verringert waren, während die Messwerte für nur 0,6 % der Gene nach 24 Stunden Knockdown um das > Dreifache sanken Hier analysierte unsortierte Kontrollproben (siehe ergänzende Abbildung 2a, b). Somit hätten 24 Stunden ausreichend Zeit für die Entwicklung robuster induzierbarer Phänotypen und auch das Einfangen gestörter Zellen gehabt, bevor sie aufgrund von Fitnessverlust kritisch vermindert wurden. Ein unerwartetes Merkmal, das sich aus dieser Analyse früherer RIT-seq-Daten ergab, war, dass der Abbau von Proteinen, die mit der DNA-Replikation verbunden sind, typischerweise keinen größeren Fitnessverlust registrierte (ergänzende Abbildung 2a, b). Dies deutet darauf hin, dass eine verringerte DNA-Replikationsrate toleriert werden kann, obwohl die S-Phase verlängert wird (siehe unten), die jedoch relativ geringe Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit hat. Jede sortierte Beispielbibliothek ergab zwischen 23 und 37 Millionen zugeordnete Lesepaare; <2 C = 37 M, G1 = 35 M, S = 30 M, G2M = 23 M, > 4 C = 25 M; Dieser Satz von fünf Proben lieferte Daten für >7000 Gene, was >35.000 RNAi-Datenpunkten entspricht (Ergänzungsdaten 1).

Die digitalen RIT-seq-Daten für einzelne Gene nach dem Knockdown lieferten ein Maß für die Häufigkeit in jedem Pool und wurden daher zur digitalen Rekonstruktion von Zellzyklusprofilen für den Knockdown einzelner Gene verwendet (Abb. 1b). Wir gingen davon aus, dass wir eine Anhäufung bestimmter Knockdowns in bestimmten Phasenpools des Zellzyklus beobachten würden, was auf spezifische Defekte schließen lässt. Dies war tatsächlich der Fall, und einige Beispiele werden zur Veranschaulichung gezeigt; Kein schwerwiegender Defekt, G2M überrepräsentiert oder >4 C überrepräsentiert, nach Knockdown (Abb. 1b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Verlust einer zytoplasmatischen Dynein-Schwerkette (7.3160) die Zellzyklusverteilung nicht stört; dass das Proteasom zur Vervollständigung von G2M erforderlich ist (siehe unten); und dass der Abbau einer Flagellen-Axonemal-Dynein-Schwerkette (11.11220) in Abwesenheit von Zytokinese zu einer Endoreduplikation führt; Dyneine sind Motorproteine ​​des Zytoskeletts, die sich entweder entlang von Mikrotubuli bewegen oder das Gleiten von Mikrotubuli antreiben, um beispielsweise einen Flagellenschlag zu erzeugen30.

Das Kerngenom von T. brucei umfasst einen nicht redundanten Satz von über 7200 proteinkodierenden Sequenzen, für die wir nun nach dem Knockdown die Zellzyklusprofile digital rekonstruieren konnten. Zunächst untersuchten wir Knockdowns, die eine Überrepräsentation von > 4 C-Zellen meldeten, was auf eine Endoreduplikation hinweist, die 284 Gene ergab (Abb. 2a, linkes Feld; ergänzende Daten 1). Der >4 C-Phänotyp wurde zuvor nach dem Abbau von α-Tubulin in einer wegweisenden Studie beobachtet, die erstmals RNAi in T. brucei beschrieb24, und tatsächlich beobachteten wir eine ausgeprägte Überrepräsentation von >4 C-Zellen sowohl für den Abbau benachbarter α-Tubulin- als auch β-Tubulin-Gene (Abb. 2a, mittleres und rechtes Feld). Anschließend untersuchten wir Knockdowns, die eine Überrepräsentation von <2 C-Zellen meldeten, was auf einen verringerten DNA-Gehalt hinweist, was zu 10 Treffern führte (Abb. 2b, linkes Feld; Zusatzdaten 1). Haploide Zellen wurden zuvor nach dem Herunterfahren des DOT1A-Gens beobachtet, und in Übereinstimmung mit dem vorherigen Bericht beobachteten wir eine ausgeprägte Überrepräsentation von <2 C-Zellen für den Herunterfahren des DOT1A-Gens (Abb. 2b, mittleres und rechtes Feld); Uns sind keine anderen Knockdowns bekannt, die einen ähnlichen Phänotyp ergeben. Tatsächlich kodieren andere „<2 C-Treffer“ meist kleine hypothetische Proteine, von denen sieben 73 ± 11 % kürzer als der Durchschnitt sind, was mit einer geringen Lesezahl und Unterabtastung für diese Treffer vereinbar ist (ergänzende Abbildung 2c). Die verbleibenden zwei Treffer sind ein Histon-Chaperon (ASF1B) und ein glykolytisches Enzym (PFK). Zusammengenommen lieferten diese Ergebnisse eine erste Validierung für die >4 C- und <2 C-Komponenten des Bildschirms.

a Das Diagramm auf der linken Seite zeigt Knockdowns, die im >4-C-Experiment überrepräsentiert waren, in Rot; diejenigen mit Lesevorgängen im >4 C-Pool, die den mittleren Fold-Change-Wert um das >1,75-fache der SD überstiegen, was dem >1,117-fachen der Summe der Lesevorgänge in den G1-, S-Phase- und G2M-Proben zusammengenommen entspricht. Das Read-Mapping-Profil und die Read-Counts für α/β-Tubulin sind rechts dargestellt. b Das Diagramm auf der linken Seite zeigt Knockdowns, die im Sub-2C-Experiment überrepräsentiert waren, in Orange; diejenigen mit Lesevorgängen im Sub-2C-Pool, die den mittleren Fold-Change-Wert um das >1,75-fache der SD übertrafen, was dem >4-fachen der Summe der Lesevorgänge in den G1-, S-Phase- und G2M-Proben zusammengenommen entspricht. Das Lesezuordnungsprofil und die Leseanzahl für DOT1A werden rechts angezeigt. c Das RadViz-Diagramm zeigt Knockdowns, die eine um mehr als 25 % überrepräsentierte Leseanzahl in den Kategorien G1 (lila), S-Phase (grün) oder G2M (blau) registrierten. d Lesezuordnungsprofile und relative Lesezahlen für Beispieltreffer. PCNA, proliferierendes Zellkernantigen; PPL2, PrimPol-like 2. e Das Venn-Diagramm zeigt die Verteilung der Knockdowns, die in jedem Arm des Bildschirms überrepräsentiert sind.

Als nächstes richteten wir unsere Aufmerksamkeit auf Knockdowns, die eine Überrepräsentation von G1-, S-Phasen- oder G2M-Zellen meldeten. Die Knockdown-Pools, die in jeder dieser Kategorien eine um > 25 % überrepräsentierte Lesezahl verzeichneten, sind im RadViz-Diagramm in Abb. 2c hervorgehoben (siehe auch Zusatzdaten 1), und Daten für ein Beispiel aus jeder Kategorie sind in Abb. 2d dargestellt; das glykolytische Enzym Aldolase berichtete über einen Anstieg der G1-Zellen um 104 % (weitere Einzelheiten unten); Das proliferierende Zellkernantigen (PCNA), eine DNA-Schiebeklemme, die ein zentraler Bestandteil der Replikationsmaschinerie ist32, verzeichnete einen Anstieg von 25 % bei S-Phasen-Zellen und 13 % bei G2M-Zellen, was mit früheren Analysen übereinstimmt33; und PrimPol-like 2 (PPL2), eine Post-Replikations-Transläsionspolymerase, berichtete über einen Anstieg der G2M-Zellen um 65 %, was ebenfalls mit früheren Analysen übereinstimmt34. Diese Ergebnisse lieferten eine erste Validierung für die G1-, S-Phase- und G2M-Komponenten des Bildschirms. Der vollständige Datensatz kann mit einem interaktiven, frei zugänglichen Online-Datenvisualisierungstool durchsucht und durchsucht werden (siehe ergänzende Abbildung 3; https://tryp-cycle.pages.dev/).

Insgesamt ergaben die fünf Komponenten des Screenings 1198 Gene, die einen Zellzyklusdefekt registrierten, basierend auf den oben angewendeten Schwellenwerten. Dies sind 16,6 % der 7205 analysierten Gene, und die Verteilung dieser Gene auf die fünf Arme des Screens ist im Venn-Diagramm in Abb. 2e dargestellt. Da wir vorhergesagt haben, dass Knockdowns, die mit einem Zellzyklusdefekt einhergehen, mit größerer Wahrscheinlichkeit auch einen Wachstumsdefekt registrieren, haben wir diese Datensätze mit früheren RIT-seq-Fitnessprofildaten verglichen23. Alle Gruppen von Genen, die Zellzyklusdefekte registrierten, mit Ausnahme des kleinen Satzes <2 C, wurden signifikant für Gene angereichert, die zuvor einen Fitnessverlust-Phänotyp nach Knockdown in Zellen in Blutkreislaufform registrierten (χ2-Test; <2 C, p = 0,93; G1, p = 0,04; S-Phase, p = 1,3–4; G2M, p = 1,3–23; >4 C, p = 9,4–213), was mit einem Fitnessverlust als häufigem Ergebnis nach einer Zelle übereinstimmt Zyklusverlaufsdefekt. Zusammengenommen lieferten die obigen Analysen eine Validierung für den RIT-seq-basierten Zellzyklus-Phänotypisierungsansatz und ergaben mehr als 1000 Kandidatenproteine, die das Fortschreiten durch bestimmte Schritte des T. brucei-Zellzyklus beeinflussen.

In der Blutstromform T. brucei können durch Endoreduplikation ohne Zytokinese defekte >4 C-Zellen entstehen, entweder mit24 oder ohne25,26 Mitose. Endoreduplikationsdefekte wurden zuvor nach dem Abbau von α-Tubulin24 oder Flagellenproteinen beobachtet7,35; im Einklang mit der Ansicht, dass der Flagellenschlag für die Zytokinese im Blutkreislauf von T. brucei erforderlich ist. Wie oben gezeigt, gehörten die Knockdowns der schweren Kette von Dynein (siehe Abb. 1b), α-Tubulin und β-Tubulin (siehe Abb. 2a) zu den 284 Knockdowns, die im endoredupplizierten Pool in unserem Screen überrepräsentiert waren. Gene Ontology (GO)-Annotationen, die strukturierte Beschreibungen von Genprodukten in Bezug auf Funktionen, Prozesse und Kompartimente liefern, wurden ausgewertet, um diese Kohorte von Knockdowns weiter zu profilieren. Zu den im Zusammenhang mit einem Endoreduplikationsdefekt überrepräsentierten Begriffen gehörten „Dynein“, „intraflagellarer Transport“ (IFT), „Axonem“ und „Zytoskelett“ sowie „Chaperonin-T-Komplex“, „Zytokinese“ und „Zellzyklus“ (Abb. 3a). ). Das Geigendiagramm in Abb. 3b zeigt die spezifische Anreicherung von IFT und Dynein-Knockdowns in Verbindung mit der Endoreduplikation. Exozystenkomponenten, die hauptsächlich an der Exozytose36 beteiligt sind, wurden als Kontrollkohorte einbezogen, da keine der Exozystenkomponenten eine Anreicherung im >4 C-Pool oder in einem anderen hier analysierten experimentellen Pool verzeichnete (siehe unten). Die Anreicherung einzelner Chaperonin-T-Komplex-Komponenten, Dyneine und IFT-Faktoren im >4 C-Pool ist in Abb. 3c dargestellt. Der Chaperonin-T-Komplex ist an der Faltung von Tubulin und Aktin beteiligt , und insbesondere war der Abbau von Aktin auch mit der Endoreduplikation verbunden (ergänzende Abbildung 4).

a Das Balkendiagramm zeigt angereicherte Gene-Ontologie-Terme, die mit den >4 C-Treffern verbunden sind, also jenen, die den mittleren Fold-Change-Wert in diesem Satz um das >1,75-fache der SD überschreiten. P-Werte werden rechts angezeigt. b Das Violindiagramm zeigt relative Lesezahlen von >4 C für Genkohorten und spiegelt die Datenverteilung wider. Offene Kreise geben Medianwerte an und die vertikalen Balken geben 95 %-Konfidenzintervalle an. Deutlich überrepräsentierte Kohorten sind rot gekennzeichnet. c Die Diagramme zeigen eine Überrepräsentation der T-Komplex-, Dynein- und intraflagellaren Transportfaktoren (IFT) in Rot im >4 C-Experiment. d Die Heatmaps zeigen die relative Darstellung in allen fünf sortierten Pools für die oben genannten und zusätzliche Kohorten von Knockdowns; blau, am stärksten überrepräsentiert. e Beispiel-Read-Mapping-Profile für Treffer, die im >4 C-Pool überrepräsentiert sind. f Beispiel-Read-Mapping-Profile für Ziliopathie-assoziierte Treffer, die im >4 C-Pool überrepräsentiert sind. CMF-Komponente von beweglichen Flagellen, CFAP-Zilien und Flagellen-assoziiertem Protein.

Die Heatmap in Abb. 3d zeigt die Daten für alle fünf sortierten Pools für die oben beschriebenen Kohorten und für zusätzliche Kohorten von Knockdowns, die im >4 C-Pool angereichert sind; Dazu gehören zusätzliche Dyneinketten, Radial-Spoke-Proteine, extraaxonemale paraflagellare Stäbchenproteine ​​(PFR) sowie Nukleoporine. Die Galerie in Abb. 3e zeigt Beispiele von RIT-seq-Read-Mapping-Profilen für 26 einzelne Gene, die nach dem Knockdown eine Anreicherung von >4 C registrieren. Zusätzlich zu den oben genannten Kategorien gehören dazu die inneren Armproteine ​​Dynein 5-138 und FAZ, die die Anheftung des Flagellums an den Zellkörper vermitteln39; alle vier Zytokinese-Initiationsfaktoren CIF1-440 und Komponenten des chromosomalen Passagierkomplexes, einschließlich CPC1 und der Aurora-B-Kinase AUK1. AUK1 und CPC1 sind spindelassoziiert und regulieren Mitose und Zytokinese26,41. Bemerkenswerterweise wurde zuvor über eine Endoreduplikation nach AUK1-Knockdown im Blutkreislauf von T. brucei42 berichtet, und dies ist die Kinase mit der stärksten Überrepräsentation in unserem >4 C-Datensatz. Die nächste >4 C überrepräsentierte Kinase ist die CMGC/RCK (Tb927.3.690), deren Abbau zuvor zu einem auffälligen Zytokinese-Defekt führte43.

Weitere Beispiele für Gene, die eine Überrepräsentation von >4 C registrieren, sind das Centriole-Cartwheel-Protein SAS644, das Spaltfurchen-lokalisierende Protein FRW145, das Basalkörper-Axonem-Übergangszonenprotein TZP12546 und das Basalkörperprotein BBP24847. Einhundert weitere Beispiele sind in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt, darunter intermediäre und leichte Ketten-Dyneine, andere Flagellum-assoziierte Faktoren, Radialspeichenproteine, Komponenten beweglicher Flagellen, Flagellum-Anheftungs- und Übergangszonenproteine, Kinesine48,49, Nukleoporine50 und viele frühere uncharakterisierte hypothetische Proteine. Einige andere bemerkenswerte Beispiele sind das Mikrotubuli-trennende Katanin KAT8051, der Dynein-Regulationsfaktor Trypanin52, das AIR9-Mikrotubuli-assoziierte Protein53, CAP51V54 und das Importin IMP155.

Orthologe mehrerer Flagellenproteine ​​von T. brucei wurden zuvor mit schwächenden menschlichen Ziliopathien in Verbindung gebracht, sodass das Trypanosom-Flagellum als Modell für Studien zu diesen Defekten genutzt wird7. Defekte im intraflagellaren Dyneintransport werden beispielsweise mit Atemwegsinfektionen in Verbindung gebracht9. Orthologe von DNAH (10.5350 und 11.8160, Abb. 3e) sind mit männlicher Unfruchtbarkeit verbunden, während zusätzliche Ciliopathie-assoziierte Orthologe, die eine Überrepräsentation im >4 C-Pool verzeichnen, in Abb. 3f und der ergänzenden Abb. 4 dargestellt sind. Dazu gehören Orthologe von Proteinen verbunden mit primärer Ziliardyskinesie (DNAH5, DNAH11, RSPH4 und DNAI1)11; männliche Unfruchtbarkeit (PF16, PACRGA, CFAP43 und CMF7/TbCFAP44)7,10; und Zapfen-Stäbchen-Dystrophien sowie andere Augendefekte (CMF17, CMF39 und CMF46)8.

Aus der Analyse der Knockdowns, die im >4 C-Pool überrepräsentiert sind, schließen wir, dass das RIT-seq-Screening eine umfassende Identifizierung von Zytokinesedefekten im Blutkreislauf von T. brucei im Genommaßstab ermöglichte. Endoreduplikation scheint ein häufiges Ergebnis nach einem Zytokinesedefekt zu sein. Unter Hunderten von Genen, die für die Progression durch Zytokinese erforderlich sind, spielten Flagellenproteine ​​eine herausragende Rolle, darunter die meisten Dyneinketten und intraflagellaren Transportfaktoren. Viele dieser Faktoren sind für die Lebensfähigkeit von wesentlicher Bedeutung und umfassen potenzielle medikamentöse Ziele in Trypanosomatiden sowie Orthologe von Proteinen, die mit Ciliopathien assoziiert sind.

Ein DNA-Replikations- oder Mitosedefekt, gefolgt von einer Zytokinese, kann zur Bildung von Zellen führen, die Kern-DNA mit einem DNA-Gehalt von unter 2C behalten. Wir betonen hier die Beibehaltung der Kern-DNA, da bereits früher über Zellen von T. brucei berichtet wurde, denen Kern-DNA fehlt, die als Zoids bezeichnet werden und die auf eine asymmetrische Zellteilung zurückzuführen sind. Zoids werden typischerweise beobachtet, wenn die DNA-Replikation oder -Mitose in Zellen im Insektenstadium gestört ist16,25,56. Der Zoid-Phänotyp ist in den von uns hier analysierten entwicklungsbedingt unterschiedlichen Blutkreislaufformzellen57 typischerweise entweder nicht vorhanden oder weniger ausgeprägt. Dennoch werden alle im <2 C-Pool vorhandenen Zoids mit RIT-seq nicht erkannt, da der Nachweis auf der Anwesenheit eines nuklearen RNAi-Zielfragments beruht.

Zehn Knockdowns waren im RIT-seq-Screening-Datensatz <2 C (Ergänzungsdaten 1) überrepräsentiert, einschließlich der zuvor identifizierten Histon-Methyltransferase DOT1A (Abb. 2b). DOT1A ist für die Dimethylierung des Histons H3K76 verantwortlich, und der DOT1A-Knockdown führt zu Mitose und Zytokinese ohne DNA-Replikation, wodurch Zellen mit einem haploiden DNA-Gehalt entstehen 31. Unsere Daten legen nahe, dass nur wenige zusätzliche Knockdowns einen ähnlichen Phänotyp im Blutkreislauf von T. brucei ergeben.

Als nächstes analysierten wir Knockdowns, die in den G1-, S-Phase- oder G2M-Pools überrepräsentiert waren. Mehrere hundert Knockdowns verzeichneten in jeder dieser Kategorien eine um > 25 % überrepräsentierte Lesezahl (Abb. 2c, e). GO-Anmerkungen innerhalb jeder Kohorte zeigten eine Reihe angereicherter Begriffe (Abb. 4a). Überrepräsentierte Knockdowns waren mit Glykolyse, mRNA-Bindung und dem Mitochondrium im G1-Pool verbunden, mit DNA-Replikation im S-Phasen-Pool und mit einem weitgehend ähnlichen Profil wie für den >4 C-Satz im G2M-Pool.

a Die Balkendiagramme zeigen angereicherte Gene-Ontologie-Begriffe, die mit den G1-, S-Phase- oder G2M-Treffern verknüpft sind, d. h. diejenigen, die in jeder dieser Kategorien eine um mehr als 25 % überrepräsentierte Lesezahl verzeichnen. P-Werte werden rechts angezeigt. b Die Violindiagramme zeigen relative G1-, S-Phasen- oder G2M-Read-Counts für Kohorten von Genen und spiegeln die Datenverteilung wider. Offene Kreise geben Medianwerte an und die vertikalen Balken geben 95 %-Konfidenzintervalle an. Überrepräsentierte Kohorten werden jeweils in Lila, Grün und Blau angezeigt. IFT intraflagellarer Transport. c Die Heatmaps zeigen die relative Darstellung in allen fünf sortierten Pools für die oben genannten und weitere Kohorten von Knockdowns; blau, am stärksten überrepräsentiert. Aufrechterhaltung der MCM-Minichromosomen, PSP1-DNA-Polymerase-Suppressor 1.

Die Violindiagramme in Abb. 4b zeigen die spezifische Anreicherung einzelner Knockdowns für glykolytische Enzyme und eine Untergruppe von mRNA-bindenden Proteinen im G1-Pool, für DNA-Replikationsfaktoren im S-Phasen-Pool sowie Proteasomkomponenten und eine Untergruppe von Kinetochorkomponenten im G2M Becken (Abb. 4b). Die Überschneidung zwischen Knockdowns, die sich sowohl im G2M- als auch im >4 C-Pool ansammeln, spiegelt wahrscheinlich Zytokinesedefekte wider, wobei sich Zellen sowohl vor als auch nach der Endoreduplikation ansammeln; Vergleichen Sie beispielsweise G2M- und >4 C-Daten für IFT-Faktoren und Dyneine in Abb. 4b und Abb. 3b. Andere durch Mitose oder Zytokinese gestörte Phänotypen sind wahrscheinlich nicht mit einer wesentlichen Endoreduplikation verbunden; siehe zum Beispiel die Kinetochor- und Proteasom-Kohorten in Abb. 4b. Auch hier stellte die Exozyste eine Kontrollkohorte ohne Komponenten dar, die nach dem Knockdown eine Anreicherung in den G1-, S-Phasen- oder G2M-Pools registrierten (Abb. 4b).

Die Heatmap in Abb. 4c zeigt die Daten für alle fünf sortierten Pools für die oben beschriebenen Kohorten und für zusätzliche Knockdowns, die in der G1- oder S-Phase (tRNA-Synthetasen), der S-Phase (Kernhistone) oder den G2M-Pools (PSP1, DNA) angereichert sind Polymerase-Suppressor 1) oder in keinem Pool angereichert. Diese letztgenannten Sätze stellen weitere Kontrollen bereit, die offenbar keine wesentlichen Auswirkungen auf den Zellzyklusfortschritt haben, einschließlich des mitochondrialen RNA-Editing-Accessoire-Komplexes MRB158 und des mitochondrialen ATP-Synthase-Komplexes V59. So identifizieren wir Proteinkomplexe, Signalwege und regulatorische Faktoren, die speziell für fortschreitende Schritte durch den Trypanosomen-Zellzyklus erforderlich sind.

Als nächstes haben wir einige der oben beschriebenen Trefferkohorten genauer untersucht. Glykolytische Enzyme sind unter den Knockdowns, die sich im G1-Pool ansammeln, besonders hervorzuheben, und wir veranschaulichen die RIT-seq-Profilierungsdaten für diese Enzyme in Abb. 5a. Sieben von elf glykolytischen Enzym-Knockdowns verzeichnen eine Überrepräsentation von >25 % im G1-Pool; Hexokinase, Phosphofructokinase, Aldolase (siehe Abb. 2c), Triosephosphat-Isomerase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Phosphoglyceratkinase C und Pyruvatkinase. Die Glykolyse findet in peroxisomähnlichen Organellen statt, die in Trypanosomen als Glykosomen bekannt sind, und gilt als die einzige ATP-Quelle in blutbildenden Zellen12. Die Glykolyse liefert auch Stoffwechselzwischenprodukte, die die Nukleotidproduktion unterstützen. Bemerkenswerterweise geht die Proliferation von Säugetierzellen mit der Aktivierung der Glykolyse einher, und der Warburg-Effekt hängt mit diesem Phänomen in der Onkologie zusammen60,61. Tatsächlich reguliert Hexokinase den G1/S-Kontrollpunkt in Tumorzellen62. Die Ergebnisse stimmen auch mit der Beobachtung überein, dass sich T. brucei unter wachstumsbegrenzenden Bedingungen63 oder während der Differenzierung zur sich nicht teilenden Stumpy-Form64 in G1 oder G0 anreichert, was möglicherweise auf eine Rolle der Glukosewahrnehmung bei der Differenzierung zurückzuführen ist65. Bemerkenswert ist, dass glykolytische Enzyme in Stumpy-Form-Zellen um das 6,7 ± 5,2-fache herunterreguliert sind66. Wir kommen zu dem Schluss, dass es wie bei anderen Organismen67 auch bei T. brucei eine metabolische Kontrolle des Zellzyklus und einen nährstoffempfindlichen Restriktionspunkt gibt, wobei die Glykolyse eine Rolle beim Übergang von der G1- zur S-Phase und möglicherweise auch beim G1/G0-Übergang spielt.

a Das RadViz-Diagramm zeigt den Abbau glykolytischer Enzyme. Angegeben sind diejenigen, die in der Kategorie G1 mehr als 25 % überrepräsentierte Lesezahlen verzeichneten. Schwarze Datenpunkte zeigen andere Gene aus jeder Kohorte an. Graue Datenpunkte zeigen alle anderen Gene an. Die Lesezuordnungsprofile und relativen Lesezahlen im unteren Bereich zeigen Beispieltreffer. b Wie in a, jedoch bei DNA-Replikationsinitiationsfaktor-Knockdowns, bei denen mehr als 25 % überrepräsentierte Lesezahlen registriert wurden, vor allem in der S-Phasen-Kategorie. c Wie in a, aber für Proteasom-Komponenten-Knockdowns, die mehr als 25 % überrepräsentierte Lesezahlen registrierten, hauptsächlich in der G2M-Kategorie. d Wie in a, jedoch für Kinetochor-Komponenten-Knockdowns, bei denen mehr als 25 % überrepräsentierte Lesezahlen registriert wurden, hauptsächlich in der G2M-Kategorie.

Bei den Knockdowns, die sich in der S-Phase ansammeln, sind DNA-Replikationsinitiationsfaktoren besonders hervorzuheben, und wir veranschaulichen die RIT-seq-Profilierungsdaten für diese Faktoren in Abb. 5b. Fünf Knockdowns, die eine Überrepräsentation von >25 % im S-Phasen-Pool verzeichnen, sind Bestandteile der eukaryotischen replikativen Helikase, des CMG-Komplexes (Cdc45-MCM-GINS). Das Herzstück dieses Komplexes ist der Minichromosomen-Erhaltungskomplex (MCM2-7), eine Helikase, die die Duplex-DNA vor der sich bewegenden Replikationsgabel abwickelt68. Die Identifizierung der Komponenten des CMG-Komplexes legt nahe, dass jede dieser Untereinheiten für den rechtzeitigen Übergang durch die S-Phase erforderlich ist.

Die Proteasom-Aktivität fördert die Mitose in T. brucei69 und in Übereinstimmung damit sind Proteasom-Komponenten bei Knockdowns, die sich in G2M ansammeln, besonders hervorzuheben; Wir veranschaulichen die RIT-seq-Profilierungsdaten für diesen Proteinkomplex in Abb. 5c. Sechzehn von 28 Proteasomkomponenten-Knockdowns verzeichnen eine Überrepräsentation von >25 % im G2M-Pool. Diese Ausgabe steht im Einklang mit der Ansicht, dass das Proteasom von T. brucei für den Abbau von Zellzyklusregulatoren verantwortlich ist, wie z. B. polyubiquitinierte Cycline, von denen einige dafür bekannt sind, dass sie Zellzykluskontrollpunkte in T. brucei kontrollieren. Mögliche Ziele in T. brucei sind: CIF1, AUK170, Cyclin 6 (CYC6), dessen Abbau für die Mitose erforderlich ist71; Cyclin-ähnliches CFB2, erforderlich für die Zytokinese72; und Cyclin 2 (CYC2) oder Cyclin 3 (CYC3), die im Fall von CYC373 kurze Halbwertszeiten und ein mögliches Destruction-Box-Motiv aufweisen.

Kinetochor-Komponenten17 gehören ebenfalls zu den Knockdowns, die sich in G2M ansammeln, und wir veranschaulichen die RIT-seq-Profilierungsdaten für diesen Proteinkomplex in Abb. 5d. Obwohl der Abbau von KKT2, einer mutmaßlichen Kinase, eine Überrepräsentation im S-Phasen-Pool verzeichnete, verzeichneten KKT1-, KKT7- und KKT10/CLK1-Knockdowns im G2M-Pool eine Überrepräsentation von >25 %, was darauf hindeutet, dass diese besonderen Kinetochor-Komponenten, die alle zeitliche Muster der Phosphorylierung aufweisen, von S-Phase bis G2M21 sind für das Fortschreiten durch die Mitose erforderlich. Insbesondere ist KKT10 eine Kinase, die für die Phosphorylierung von KKT7 verantwortlich ist, das für den Übergang von Metaphase zu Anaphase erforderlich ist74; sowie für die Phosphorylierung von KKT1 und KKT2, die wiederum für den Kinetochor-Zusammenbau erforderlich sind75,76. Diese Ergebnisse stimmen mit der Ansicht überein, dass Kinetochorkomponenten einen nicht-kanonischen Spindelkontrollpunkt in Trypanosomen steuern74.

Die weit verbreitete polycistronische Transkription in Trypanosomatiden legt großen Wert auf posttranskriptionelle Kontrollen, und in Übereinstimmung damit zeigten Knockdowns, die in den G1-, S-Phasen- und G2M-Pools überrepräsentiert waren, viele mutmaßliche mRNA-Bindungsproteine ​​(RBPs) und Kinasen. Tatsächlich sind RBPs bei Knockdowns, die G1-, S-Phasen- oder G2M-Zellzyklusdefekte registrierten, erheblich angereichert (χ2-Test, p = 7–5). Wir zeigen die RIT-seq-Profiling-Daten für elf RBP-Knockdowns, die in diesen Pools eine Überrepräsentation von > 25 % verzeichnen (Abb. 6a). Dazu gehören Knockdowns für RBP10 und RBP29, angereichert mit G1; Insbesondere RBP10 wurde ausführlich charakterisiert und fördert den Zustand der Blutkreislaufform77. Die Knockdowns von ZC3H1178, ZC3H41 und ZC3H2879 wurden in G1, S-Phase bzw. G2M angereichert, während Knockdowns von CFB2, MKT1 oder PBP1, die alle kürzlich mit der Expressionskontrolle von Varianten-Oberflächenglykoproteinen verknüpft waren, in G2M angereichert wurden. Basierend auf den Ergebnissen des aktuellen Bildschirms haben wir diese drei letztgenannten RBPs für die Folgeanalyse in einer separaten Studie priorisiert; alle drei wurden dadurch als G2M-Treffer validiert80. Somit beteiligte das RIT-seq-Zellzyklus-Screening eine Reihe spezifischer RBPs an der posttranskriptionellen Kontrolle des Zellzyklusverlaufs durch Modulation der mRNA-Stabilität und/oder -Translation.

a Das RadViz-Diagramm zeigt mRNA-Bindungsprotein-Knockdowns (RBPs). Diejenigen, die >25 % überrepräsentierte Lesezahlen in den Kategorien G1, S-Phase oder G2M registrierten, werden in Lila, Grün bzw. Blau angezeigt. Die Lesezuordnungsprofile und relativen Lesezahlen in den anderen Bereichen zeigen Beispieltreffer. b Wie in a, jedoch für Proteinkinase-Knockdowns, wobei ausgewählte Kinasen angegeben sind. c Wie in a, aber für hypothetische (konservierte) Protein-Knockdowns.

Wir zeigen oben Daten für Proteinkinasen, die mit angereicherten Phänotypen von >4 C (Abb. 3d), S-Phase oder G2M (Abb. 5d) verknüpft sind, und zeigen nun die RIT-seq-Profilierungsdaten für fünf weitere Proteinkinase-Knockdowns, die >25 registrieren % Überrepräsentation in den G1-, S-Phase- oder G2M-Pools (Abb. 6b). Dazu gehören Knockdowns für CRK7, verbunden mit der Akkumulation in G1; MAPK5, verbunden mit der Akkumulation in der S-Phase und Polo-like-Kinase (PLK) und cdc2-verwandte Kinase 3 (CRK3), verbunden mit der Akkumulation in G2M. Es wurde zuvor gezeigt, dass PLK die Zellmorphologie, das Eindringen von Furchen und die Zytokinese steuert82,83,84, während CRK3 nachweislich eine Rolle bei der G2M-Progression im Blutkreislauf von T. brucei spielt43,85. Die Gesamtübereinstimmung mit einem früheren kinomweiten RNAi-Screen war ebenfalls ausgezeichnet43. Beispielsweise berichteten acht von neun Kinasen, die in diesem Screening mit einem Mitosedefekt in Zusammenhang standen, auch im aktuellen Screening über einen (21 ± 12 %) Anstieg des G2M-Pools.

Schließlich analysierten wir Gene, die für Proteine ​​kodieren, die als hypothetisch (konserviert) bezeichnet wurden. Trotz hervorragender Fortschritte bei der Annotation des Genoms behalten 35 % der nicht-redundanten Gene in T. brucei diese Annotation bei, was mehr als 2500 Genen entspricht. Wir zeigen oben Daten für mehrere hypothetische Protein-Knockdowns, die mit dem angereicherten > 4 C-Phänotyp verknüpft sind (ergänzende Abbildung 4), und wir identifizieren hier > 300 zusätzliche hypothetische Protein-Knockdowns, die eine Überrepräsentation von > 25 % in den G1-, S-Phasen- oder G2M-Pools verzeichnen . RIT-seq-Profilierungsdaten sind für fünf Beispiele in Abb. 6c und für mehrere weitere Beispiele in der ergänzenden Abb. 5 dargestellt. Zu den weiteren in der ergänzenden Abb. 5 gezeigten Beispielen für Knockdowns gehören alternative Oxidase86, die mit der G1-Anreicherung verknüpft sind; Kinesine, die mit der G2M-Anreicherung verbunden sind, einschließlich der beiden Kinesine des chromosomalen Passagierkomplexes (KIN-A und KIN-B)26 und KIN-G; CYC625,87, Centrin 388 und schließlich beide Komponenten des Histon-Chaperon-FACT-Komplexes (erleichtert die Chromatintranskription)89 Spt16 und Pob3, verbunden mit der G2M-Anreicherung. Insbesondere wurde der FACT-Komplex mit der Zentromerfunktion in menschlichen Zellen in Verbindung gebracht90.

Faktoren, die für das Fortschreiten des Zellzyklus erforderlich sind, können selbst vom Zellzyklus reguliert werden. Um einige dieser Faktoren zu identifizieren, verglichen wir unseren aktuellen Datensatz mit quantitativen Transkriptom-19-, Proteom-20- und Phosphoproteom-21-Zellzyklus-Profilierungsdaten (Ergänzungsdaten 1). Eine erste Untersuchung aller 1.198 Gene, die hier einen Zellzyklusdefekt registrierten (siehe Abb. 2e), ergab eine signifikante Anreicherung zellzyklusregulierter mRNAs (Überlappung = 114 von 484, χ2 p = 3,2–4) und Proteinen, die eine zellzyklusregulierte Phosphorylierung aufweisen (Überlappung = 112 von 547, χ2 p = 0,025). Dies trotz der Tatsache, dass die Transkriptom- und (Phospho)Proteom-Datensätze von T. brucei im Insektenstadium abgeleitet wurden, sodass die Regulation in den hier für die RIT-seq-Analyse verwendeten T. brucei-Zellen im Blutkreislauf unterschiedlich sein kann.

In Bezug auf spezifische Zellzyklus-regulierte Proteine20, die für bestimmte Zellzyklus-Fortschrittsschritte erforderlich sind, waren mehrere in G1 hochregulierte glykolytische Enzyme mit der Akkumulation im G1-Pool nach dem Knockdown verbunden (χ2 p = 7,9–11). Darüber hinaus waren in G2 und M hochregulierte Proteine ​​mit einer Akkumulation im G2M- (χ2 p = 1,8–8) oder >4 C-Pool (χ2 p = 8,9–9) nach dem Abbau verbunden, einschließlich Kinetochor- bzw. chromosomaler Passagierkomplexkomponenten. Einige spezifische Transkripte, die für das Fortschreiten des Zellzyklus erforderlich sind, können hochreguliert werden, bevor die Nachfrage nach dem kodierten Protein ihren Höhepunkt erreicht, und wir haben Beweise gefunden, die diese Ansicht stützen. Beispielsweise wurden in der späten G1- oder in der S-Phase hochregulierte Transkripte unter den Knockdowns angereichert, die mit der Akkumulation im G2M-Pool verbunden waren (χ2 p = 3,3 − 3 bzw. p = 0,011); beide Komponenten des FACT-Komplexes, beispielsweise in G1 hochreguliert (siehe ergänzende Abbildung 5). In ähnlicher Weise wurden hochregulierte S-Phase- und G2M-Transkripte, einschließlich derjenigen, die für mehrere Flagellum-assoziierte Proteine ​​kodieren, durch Knockdowns angereichert, die mit der Akkumulation im >4 C-Pool verbunden waren (χ2 p = 4,6–18 bzw. p = 2,4–5).

Einige Proteine ​​zeigten sowohl durch den Zellzyklus regulierte Expressions- als auch Phosphorylierungsmuster, die mit ihrer Rolle im Zellzyklusverlauf übereinstimmten. Dazu gehörten mutmaßliche RBPs der DNA-Polymerase-Suppressor-1-Familie (PSP1), die eine mRNA-Hochregulierung in G1, eine Protein-Hochregulierung in der S-Phase, eine durch den Zellzyklus regulierte Phosphorylierung und nach dem Abbau eine Akkumulation in G2M aufweisen (siehe Abb. 4c und 6a). Die Kinetochor-Komponenten KKT1 und KKT7 sowie CRK3 zeigen alle eine mRNA-Hochregulierung in der S-Phase, eine Protein-Hochregulierung in G2 und M, eine durch den Zellzyklus regulierte Phosphorylierung und nach dem Abbau eine Akkumulation in G2M (siehe Abb. 5d und 6b); KKT10 und CYC6 berichten über ein ähnliches Profil (siehe Abb. 5d), mit Ausnahme der mRNA-Regulationskomponente. Die Zytokinese-Initiationsfaktoren CIF1 und CIF2 zeigen eine mRNA-Hochregulierung in der S-Phase, eine Protein-Hochregulierung in G2 und M, eine durch den Zellzyklus regulierte Phosphorylierung und nach dem Abbau eine Akkumulation im endoreduplizierten Pool (siehe Abb. 3e). Schließlich berichten die chromosomalen Passagierkomplexkomponenten CPC1 und AUK1 sowie das in der Furche lokalisierte FRW1 über eine mRNA- und Protein-Hochregulierung in G2M und nach dem Abbau über eine Akkumulation im endoreduplizierten Pool (siehe Abb. 3e). Somit werden mehrere Regulatoren, die durch RIT-seq-Profiling mit spezifischen Zellzyklus-Progressionsdefekten in Verbindung gebracht werden, selbst durch den Zellzyklus reguliert.

Das aktuelle RIT-seq-Screening identifizierte viele neue Kandidaten für Zellzyklusregulatoren, von denen zwei, die beide in unserem vorherigen RIT-seq-Screening mit einem erheblichen Fitnessverlust verbunden waren23, detaillierter untersucht wurden. Erstens war Tb927.10.970 mit einer ausgeprägten Endoreduplikation nach dem Knockdown verbunden (Abb. 7a). Das vorhergesagte Protein enthält ein Tetratricopeptid-Wiederholungsmotiv, eine Gruppe von Phosphorylierungsstellen, von denen berichtet wurde, dass eine davon, T706, zellzyklusreguliert ist und ihren Höhepunkt im späten G2M21 erreicht, und eine Reihe mutmaßlicher Calmodulin-bindender IQ-Domänen (Abb. 7b). . Es wurde gezeigt, dass Tb927.10.970 im Insektenstadium T. brucei im paraflagellaren Stab lokalisiert ist (www.tryptag.org91,92). Um Tb927.10.970 als >4 C-Hit in Trypanosomen in Blutkreislaufform zu validieren, haben wir ein Paar unabhängiger induzierbarer RNAi-Knockdown-Stämme zusammengestellt. Die Analyse des Zellwachstums ergab einen schweren Fitnessverlust nach dem Knockdown, bestätigt durch qRT-PCR (Abb. 7c). Die Durchflusszytometrie bestätigte dann die Endoreduplikation, wobei markante Peaks festgestellt wurden, die 8 C- und 16 C-Zellen nach dem Knockdown repräsentierten (Abb. 7d, linkes Feld), während die mikroskopische Untersuchung dieser Zellen mehrere Zellkerne ergab, was auf eine Endoreduplikation mit fortgesetzter Mitose hinweist (Abb. 7d). , rechte Tafel).

a Kartierte Messwerte und rekonstruiertes Zellzyklusprofil nach 10.970 Knockdown. b Schematische Karte von 10.970. TPR-Tetratricopeptid-Wiederholungsmotiv, P-Phosphorylierung, IQ-Motive, mutmaßliche Calmodulin-Bindungsdomänen. c Das Diagramm auf der linken Seite zeigt einen effizienten, durch Tetracyclin (Tet) induzierten Knockdown von 10,970 nach 24 Stunden. Angegeben sind Mittelwerte und 3 technische Replikate, wobei der p-Wert mithilfe eines ungepaarten t-Tests abgeleitet wurde. Die Wachstumskurve rechts zeigt einen schweren Wachstumsdefekt nach dem Knockdown. n = 2 biologisch unabhängige Klone und die Linie gibt Mittelwerte an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d Die durchflusszytometrische Analyse ergab eine Endoreduplikation nach 24 Stunden eines 10.970-Knockdowns, basierend auf der Propidiumiodid-Färbung. Die Tore zeigen die verschiedenen Zellzyklusstadien an, basierend auf nicht induzierten (-tet) Zellen. Das rechte Feld zeigt repräsentative Zellen mit mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) gefärbter DNA vor und nach dem Knockdown. N-Kern, K-Kinetoplast.

Als nächstes richteten wir unsere Aufmerksamkeit auf Tb927.10.3970, das mit „hypothetischem Protein, konserviert“ versehen war und mit einem erhöhten DNA-Gehalt nach dem Knockdown in Verbindung gebracht wurde (Abb. 8a). Das vorhergesagte Tb927.10.3970-Protein enthält drei durch den Zellzyklus regulierte Phosphorylierungsstellen21 und eine Thioredoxin-ähnliche Domäne (Abb. 8b). Basierend auf einer Proteomanalyse wurde gezeigt, dass dieses Protein durch den Zellzyklus reguliert wird und sich im Insektenstadium T. brucei im Zellkern lokalisiert20. Um die Rolle von Tb927.10.3970 in Trypanosomen in Blutkreislaufform zu untersuchen, haben wir ein Paar unabhängig induzierbarer RNAi-Knockdown-Stämme zusammengestellt. Die Analyse des Zellwachstums ergab einen schwerwiegenden Fitnessverlust nach dem Knockdown, was durch die Überwachung der Expression von Epitop-markiertem 10.3970 bestätigt wurde (Abb. 8c). Die Durchflusszytometrie bestätigte einen erhöhten DNA-Gehalt nach dem Knockdown und zeigte auch eine erhöhte Zellgröße (Abb. 8d). Durch die mikroskopische Untersuchung dieser Zellen konnten wir sowohl die Kerne als auch die Kinetoplasten (mitochondriale Genome) beurteilen und dabei einen deutlichen Anstieg des Anteils von Zellen mit einem einzelnen Kern und einem einzelnen runden Kinetoplasten nach dem Knockdown feststellen, eine Anordnung, die typischerweise für G1-Zellen charakteristisch ist (Abb . 8e). Die quantitative Analyse dieser Kompartimente ergab einen deutlichen Anstieg des DNA-Gehalts in beiden Genomen nach dem Knockdown (Abb. 8f), was darauf hindeutet, dass sowohl die Segregation als auch die Mitose der Kinetoplasten fehlschlugen, während die Genomreplikation in unterschiedlichem Ausmaß fortschreiten konnte und vergrößerte Kinetoplasten und polyploide Kerne erzeugte. Schließlich untersuchten wir die subzelluläre Lokalisierung von Epitop-markiertem 10.3970 während des Blutkreislauf-Formzellzyklus. Quantitative Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte ein Muster, das auch in Zellen im Insektenstadium beobachtet wurde (www.tryptag.org20,91,92). 10.3970 zeigte eine Kernlokalisation, deren Intensität während des Zellzyklus zunahm und dann in postmitotischen Zellen steil abfiel (Abb. 8g). Wir kommen zu dem Schluss, dass 10.3970 ein mutmaßliches Nukleoredoxin kodiert, das vom Zellzyklus reguliert wird und sowohl für die Segregation des mitochondrialen als auch nuklearen Genoms und die Zytokinese erforderlich ist.

a Zugeordnete Messwerte und rekonstruiertes Zellzyklusprofil nach 10,3970-Knockdown. b Schematische Karte des mutmaßlichen Nukleoredoxins, kodiert durch 10.3970. TRX-Thioredoxin-ähnliche Domäne. c Die Protein-Blots auf der linken Seite zeigen einen effizienten Tetracyclin (tet)-induzierten Abbau des N-terminalen myc-markierten 10.3970 für einen repräsentativen Klon nach 24 Stunden. EF1α dient als Ladekontrolle. Die Wachstumskurve rechts zeigt einen schweren Wachstumsdefekt nach dem Knockdown. n = 2 biologisch unabhängige Klone und die Linie gibt Mittelwerte an. d Die Analyse der Durchflusszytometrie ergab einen erhöhten DNA-Gehalt nach 24 Stunden des Knockdowns bei 10,3970, basierend auf der Propidiumiodid-Färbung auf der linken Seite, und eine erhöhte Zellgröße, basierend auf dem Vorwärtsstreuprofil auf der rechten Seite. Die Tore im Profil links zeigen die verschiedenen Zellzyklusstadien an, basierend auf nicht induzierten (-tet) Zellen. e Quantifizierung von Zellen mit einem einzelnen Zellkern und einem einzelnen runden Kinetoplasten (1 N: 1Kr) vor und nach 24 Stunden 10,3970-Knockdown, basierend auf DAPI-Färbung und Mikroskopie. n = 2 biologisch unabhängige Klone und die Linien geben Mittelwerte an; n = jeweils 80 Zellen. f Die Boxplots zeigen die Quantifizierung der DAPI-Intensität von Kernen (links) und Kinetoplasten (rechts) in Zellen mit einem einzelnen Kern und einem einzelnen runden Kinetoplasten vor und nach 24 Stunden 10,3970-Knockdown; jeweils n = 100. Die Daten stammen von zwei unabhängigen Klonen und werden als schwankende Punkte angezeigt, das Kästchen gibt den IQR an, Whiskers zeigen den Wertebereich innerhalb von 1,5*IQR, die horizontalen Linien geben den Median an und die Kerben stellen 95 %-Konfidenzintervalle dar. Der Einschub rechts zeigt repräsentative Zellen vor und nach dem Abriss. N, Kern; K, Kinetoplast. g Die repräsentativen Bilder der Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen N-terminales GFP-markiertes 10.3970 (grün) in verschiedenen Zellzyklusstadien, wie durch die Kern- (N) und Kinetoplastenkonfiguration (K) definiert, die durch Anfärben von DNA mit DAPI beobachtet wird. Die Intensität des GFP10.3970-Signals wurde quantifiziert und ist in der Grafik rechts dargestellt. n = 26, 21, 5 und 6 Zellen für G1, S-Phase, G2M bzw. Post-M. Die Linien geben den Median an. Quelldaten für c und e–g werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Trotz des intensiven Interesses und der Studien13,15 müssen viele Zellzyklusregulatoren bei Trypanosomatiden noch identifiziert werden und es bleibt noch viel über die Zellzykluskontrolle und -progression bei diesen Parasiten zu lernen. Die DNA-Färbung mit anschließender Durchflusszytometrie ist ein weit verbreiteter Ansatz zur Quantifizierung des zellulären DNA-Gehalts und zur Analyse der Zellzyklusverteilung in ansonsten asynchronen Populationen. Hier kombinierten wir ein genetisches Funktionsverlust-Screening im Genommaßstab mit DNA-Färbung und Durchflusszytometrie im Blutkreislauf afrikanischer Trypanosomen und identifizierten Hunderte von Genen, die für das Fortschreiten durch bestimmte Stadien des Zellzyklus erforderlich sind.

Die funktionelle Annotation der Trypanosomatid-Genome wird weiterhin von neuartigen Hochdurchsatz-Funktionsanalysen profitieren, und der RNAi-vermittelte Knockdown hat sich als leistungsstarker Ansatz für T. brucei erwiesen. Die RIT-seq-Profilerstellung liefert Daten für fast jedes Gen und mit diesem Ansatz haben wir zuvor Daten zum Verlust der Fitness im Genommaßstab beschrieben23. Unter den 3117 Knockdowns, die in diesem Screening einen signifikanten Fitnessverlust in blutkreislaufförmigen Zellen aufwiesen (42 % aller analysierten Gene), befanden sich Gene, die alle 18 Untereinheiten des intraflagellaren Transportkomplexes (χ2 p = 1–6), 12 von 13 Dynein, kodierten schwere Ketten (χ2 p = 4−4), alle 8 TCP-1-Chaperonkomponenten (χ2 p = 1−3), 27 von 30 Nukleoporinen (χ2 p = 2−7), alle elf glykolytischen Enzyme (χ2 p = 2 −4) und 30 von 31 Proteasom-Untereinheiten (χ2 p = 2−9). Dieser Satz umfasste auch 18 von 19 Kinetochor-Proteinen (χ2 p = 6−6), die erst später als Bestandteile dieses essentiellen Komplexes identifiziert wurden17. Mit der aktuellen Studie bringen wir nun viele dieser Gene und viele weitere mit spezifischen Zellzyklusdefekten infolge des RNAi-Knockdowns in Verbindung. Insbesondere eine große Anzahl von Flagellenprotein-Knockdowns führte zu Zellen mit überschüssiger DNA, was darauf hindeutet, dass die DNA-Replikation häufig fortgesetzt wird, nachdem die Zytokinese nicht abgeschlossen werden konnte, was auf Defekte zurückzuführen ist, die während der Zytokinese selbst oder in einigen Fällen früher im Zellzyklus auftreten. Wir haben Wege und Proteinkomplexe identifiziert, die den Zellzyklusverlauf beeinflussen, wie z. B. die Glykolyse (G1/S-Übergang) und das Proteasom (G2/M-Übergang). Wir identifizieren auch viele mRNA-bindende Proteine ​​und Proteinkinasen, die an der Kontrolle des Zellzyklusverlaufs beteiligt sind. Insbesondere verknüpfen wir mehrere bekannte potenzielle und vielversprechende Wirkstoffziele mit Defekten im Zellzyklusverlauf, wie z. B. glykolytischen Enzymen93, dem Proteasom94, Kinetochorkinasen75,95 und anderen Kinasen96.

Frühere Studien zum Zellzyklus konzentrierten sich oft auf Trypanosomen-Orthologe bekannter Regulatoren aus anderen Eukaryoten. Da die Profilierung im Genommaßstab unvoreingenommen ist, bietet sie die Möglichkeit, sowohl abweichende als auch neuartige Faktoren und Regulatoren aufzudecken, die den Zellzyklusverlauf beeinflussen. Dementsprechend verknüpfen wir viele bisher nicht charakterisierte und hypothetische Proteine ​​mit unbekannter Funktion mit spezifischen Defekten im Zellzyklusverlauf. Auf diese Weise entdecken wir Mechanismen, die ihren Ursprung in einem gemeinsamen eukaryotischen Vorfahren haben, und andere, die wahrscheinlich die spezifische Biologie von Trypanosomatiden widerspiegeln. Wir haben auch unsere Zellzyklus-Profilierungsdaten mit zellzyklusregulierten Transkriptom- und (Phospho-)Proteom-Datensätzen verglichen.

Der in den Zusatzdaten 1 bereitgestellte digitale Datensatz erleichtert die weitere Abfrage und weitere Analyse der RIT-seq-Daten des Zellzyklus im Genommaßstab. Wir haben die Daten auch über ein interaktives, frei zugängliches Online-Datenvisualisierungstool (https://tryp-cycle.pages.dev/) zur Verfügung gestellt, das das Suchen und Durchsuchen von Daten ermöglicht (siehe ergänzende Abbildung 3). Der Vergleich mit bestehenden und neuen Datensätzen, einschließlich mit subzellulären Lokalisierungsdaten mit hohem Durchsatz92 www.tryptag.org, sollte zukünftige Studien erleichtern. Da genetische Screenings mit hohem Durchsatz in der Regel einen Anteil falsch positiver „Treffer“22 liefern, raten wir jedoch zur Vorsicht, insbesondere wenn die Ergebnisse überwiegend von einem einzelnen RIT-seq-Fragment generiert werden. Andererseits gibt es im aktuellen Datensatz Knockdowns, die eine potenziell informative Zellzyklus-Pool-Anreicherung aufweisen, aber die oben angewandten Schwellenwerte nicht überschreiten. Unter Berücksichtigung dieser beiden Punkte hoffen wir, dass der digitale Datensatz und das Online-Tool als wertvolle Ressourcen dienen werden. Da andere wichtige Trypanosomatiden-Parasiten, darunter andere afrikanische Trypanosomen, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax; Amerikanische Trypanosomen, Trypanosoma cruzi; und Leishmania spp. weisen ein hohes Maß an Konservierung und Syntenie mit T. brucei spp.97 auf. Die aktuellen Datensätze können auch Studien zu diesen und anderen Trypanosomatiden unterstützen und unterstützen.

Um den Wert des aktuellen RIT-seq-Datensatzes weiter zu veranschaulichen, analysierten wir zwei neuartige Treffer aus dem Bildschirm detaillierter und enthüllten eine Rolle für ein mutmaßliches Nukleoredoxin sowohl bei der Kinetoplasten- als auch bei der Kernsegregation. Obwohl die DNA-Replikation fortgesetzt wird, können Zellen, denen dieser Faktor fehlt, keine Kinetoplastenspaltung oder -trennung98, Mitose oder Zytokinese durchlaufen. Mitochondriale und nukleare DNA-Replikation und -Segregation werden während des T. brucei-Zellzyklus koordiniert13, um die Vererbung einer einzelnen Kopie jedes Genoms durch jede Tochterzelle sicherzustellen, der Mechanismus, der der Koordination zugrunde liegt, bleibt jedoch unbekannt. Die Identifizierung eines Thioredoxin-ähnlichen Proteins, das sowohl für die Kern- als auch die Kinetoplasten-DNA-Segregation erforderlich ist, legt nahe, dass Redoxsignale an der Koordination dieser Prozesse beteiligt sind. Ein vergleichbarer Phänotyp wurde nach dem Abbau sowohl der mitochondrialen als auch der nuklearen DNA-bindenden Proteine ​​UMSBP1 (Universal Minicircle Sequence Binding Protein) und UMSBP2 beobachtet, die zuvor mit der Replikation und Trennung von Kinetoplasten und nuklearer DNA im Insektenstadium T. brucei in Zusammenhang standen99,100. Bemerkenswert ist, dass sowohl die DNA-Bindung als auch die USMBP-Dimerisierung redoxreguliert sind101. Obwohl nicht im Detail verstanden, fungieren reaktive Cysteinthiole als zellzyklusassoziierte Redoxsensoren in Säugetierzellen102. Daher schlagen wir eine Rolle des aktuellen mutmaßlichen Nukleoredoxins bei der Reduzierung von Thiolen und der potenziellen Zerstörung von Disulfidbindungen in einem oder mehreren wichtigen Zellzyklusregulatoren vor. Diese Rolle könnte bei Trypanosomatiden erhalten bleiben, und tatsächlich könnte die Redoxsignalisierung eine weitere Rolle bei der Zellzykluskontrolle spielen, da unser Screening zwei zusätzliche Thioredoxin-ähnliche Proteine ​​mit spezifischen und unterschiedlichen Zellzyklusdefekten in Verbindung brachte; TRX2, ein redoxreguliertes mitochondriales Chaperon103, war mit der Akkumulation in G1 verbunden, während das mutmaßliche Thioredoxin, das von Tb927.9.12330 kodiert wird, mit der Akkumulation in G2M verbunden war (Ergänzende Daten 1). Weitere Arbeiten sind erforderlich, um zu untersuchen, wie Thiol-basierte Redoxschalter104 oder Sensormechanismen den Zellzyklusverlauf in den Trypanosomatiden choreografieren.

Zusammenfassend berichten wir über RNAi-induzierte Zellzyklusdefekte auf genomischer Ebene und identifizieren die T. brucei-Gene, die diesen Defekten zugrunde liegen. Die Ergebnisse bestätigen bekannte Rollen im Zellzyklusverlauf und liefern funktionelle Anmerkungen für viele zusätzliche Gene, darunter viele ohne vorherige funktionelle Zuordnung und viele, die Trypanosomatid-spezifisch sind. Daher verbessern die Daten nicht nur unser Verständnis des Zellzyklusverlaufs bei diesen wichtigen und unterschiedlichen Krankheitserregern, sondern sollten auch die weitere Entdeckung beschleunigen. Zusammengenommen erleichtern unsere Ergebnisse die Annotation des Genoms und liefern umfassende genetische Beweise für die Proteinkomplexe, Signalwege und regulatorischen Faktoren, die das Fortschreiten durch den Trypanosomen-Zellzyklus erleichtern und koordinieren.

Die RNAi-Bibliothek von T. brucei aus dem Blutkreislauf22 wurde in HMI-11 mit 1 μg.ml-1 Blasticidin und 0,2 μg.ml-1 Phleomycin aufgetaut und bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Nach ungefähr 48 Stunden wurden sechs Kolben vorbereitet, die jeweils 2 × 107 Zellen in 150 ml HMI-11 wie oben enthielten; Fünf davon wurden mit 1 μg.ml-1 Tetracyclin versetzt, während eines als nicht-induzierte Kontrolle diente. Die Zellen wurden unter diesen Bedingungen 24 Stunden lang gezüchtet. Blutstromform T. brucei 2T1-Zellen105 wurden wie oben in Gegenwart von 1 μg.ml-1 Phleomycin und 1 μg.ml-1 Puromycin gezüchtet. Diese Zellen wurden wie beschrieben durch Elektroporation transfiziert22 und mit 2,5 μg.ml-1 Hygromycin (RNAi-Konstrukte) oder 10 μg.ml-1 Blasticidin (Myc- oder GFP-Tagging-Konstrukte) selektiert. Der RNAi-Knockdown wurde mit 1 μg.ml-1 Tetracyclin induziert.

Proben der RNAi-Bibliothek wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 1000 g geerntet. Die Zellen aus jedem Kolben wurden dann in 25 ml 1x PBS (pH 7,0), ergänzt mit 5 mM EDTA und 1 % FBS („supplementiertes PBS“), erneut suspendiert, erneut 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert und dann erneut suspendiert 0,5 ml ergänztes PBS. Zu jeder Zellsuspension wurden 9,5 ml 1 % Formaldehyd in ergänztem PBS tropfenweise unter regelmäßigem Vortexen hinzugefügt. Die Zellen wurden weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann zweimal in 10 ml ergänztem PBS unter Verwendung der oben beschriebenen Zentrifugation gewaschen. Die Zellen wurden schließlich mit 2,5 × 107 pro ml in ergänztem PBS resuspendiert und anschließend bei 4 °C im Dunkeln gelagert. Fixierte Zellen, 3 × 108 Tet-induzierte und 107 nicht-induzierte, wurden 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert und in 10 ml ergänztem PBS mit 0,01 % Triton X-100 (Sigma Aldrich) resuspendiert. Die Zellen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, 10 Minuten bei 700 g zentrifugiert und einmal in 10 ml ergänztem PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 4 ml ergänztem PBS, das 10 μg.ml–1 Propidiumiodid (Sigma Aldrich) und 100 μg.ml–1 RNaseA (Sigma Aldrich) enthielt, resuspendiert und 45 Minuten bei 37 °C inkubiert , im Dunkeln; Anschließend wurden die Zellen auf Eis und im Dunkeln aufbewahrt. Unmittelbar vor der Sortierung wurden die Tet-induzierten Zellen filtriert (Filcon Cup-Filter, 50 μm Mesh, BD™ Medimachine) in 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen (BD Falcon). Die Zellen wurden mit dem Zellsortierer BD InfluxTM (Becton Dickinson) und der Software BD FACSortTM in der Flow Cytometry and Cell Sorting Facility der School of Life Sciences der University of Dundee sortiert. Die Zellen wurden in Pools von <2 C (~5 × 105 Zellen), 2 C (G1, 1 × 107 Zellen), 2–4 C (S, 1 × 107 Zellen), 4 C (G2M, 1 × 107 Zellen) sortiert Zellen) und >4 C (~9 × 105 Zellen) basierend auf ihrem DNA-Gehalt und gesammelt in 50-ml-Falcon-Röhrchen (BD Falcon); Die gesamte Sortierzeit betrug ca. 4 Std. Die nach 2 C, 2–4 C und 4 C sortierten Proben wurden dann zur Qualitätsprüfung nach dem Sortieren auf einem FACS LSR Fortessa-Durchflusszytometrie-Analysegerät laufen gelassen. Für die Analyse von Tb927.10.970- oder Tb927.10.3970-Knockdowns wurden 1 × 107 Zellen 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert und in ergänztem PBS gewaschen. Die Zellen wurden 10 Minuten lang in 1 % Paraformaldehyd in ergänztem PBS fixiert, gewaschen und bei 4 °C in ergänztem PBS gelagert. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 1000 g pelletiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in ergänztem PBS plus 0,01 % Triton X-100 permeabilisiert. Die Zellen wurden einmal in ergänztem PBS gewaschen, gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugation bei 700 g und dann in ergänztem PBS mit 10 μg.ml-1 Propidiumiodid und 100 μg.ml-1 RNAse A für 1 Stunde bei 37 °C gefärbt. Die Proben wurden auf einem BD FACSCanto (Becton Dickinson) analysiert. Für die Datenanalyse und Visualisierung wurde FlowJo v10.7.1 verwendet.

Die fünf Pools aus Tet-induzierten, sortierten Zellen sowie nicht-induzierten oder induzierten, aber unsortierten Zellen wurden über Nacht bei 56 °C in 50 % (v/v) Puffer AL (Qiagen) und 0,5 mg.ml-1 lysiert Proteinase K (Qiagen), um die Formaldehydvernetzung umzukehren. Anschließend wurde die genomische DNA mit dem DNeasy Blood and Tissue DNA Extraction Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert, mit der Ausnahme, dass jede Probe in 50 μl Buffer AE eluiert wurde. Die gesamte Probe (Bereich = 140–840 ng) wurde für die PCR in einer 100-μl-Reaktion unter Verwendung von OneTaq (NEB) und den Primern Lib3F (CCTCGAGGGCCAGTGAG) und Lib3R (ATCAAGCTTGGCCTGTGAG) und mit dem folgenden Programm verwendet: 94 °C für 4 Min., gefolgt von 27 Zyklen mit 94 °C für 30 Sek., 55 °C für 30 Sek. und 68 °C für 2 Min. und 10 Sek. und einer abschließenden Verlängerung bei 68 °C für 5 Min. Die PCR-Produkte wurden dann mit dem Qiaquick PCR-Extraktionskit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und in 30 μl nukleasefreiem Wasser (Ambion) eluiert; zwei Spalten pro Probe.

Gereinigte PCR-Produkte wurden zur Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung am Tayside Center for Genomic Analysis der University of Dundee verwendet. Die PCR-Produkte wurden mit einem Covaris M220-Ultraschallgerät fragmentiert (20 % Einschaltdauer, 75 W Spitzen-/Anzeigeleistung, 60 s Dauer – 3 × 20 s mit intermittierendem Spin-Down-Schritt, 18–20 °C Temperatur; was zu 250–300 bp führte). angereicherte Fragmente) und die Bibliotheken wurden mit dem Truseq Nano DNA Library Prep Kit (Illumina) vorbereitet. Die Proben wurden gemultiplext und auf einer Illumina NextSeq 500-Plattform auf einer 150-Zyklen-Ausgabekartusche v2, Paired-End, sequenziert. Jede Bibliothek wurde auf 4 Sequenzierungsspuren betrieben. Basisaufruf, Indexentfaltung, Trimmen und Qualitätskontrolle wurden in BaseSpace mit der bcl2fastq2-Konvertierungssoftware v2.17 durchgeführt.

Die Sequenzierungsdatenanalyse-Pipeline wurde von22 angepasst. Die FASTQ-Dateien mit Vorwärts- und Rückwärts-Paired-End-Reads (4 technische Replikate für jede Probe) wurden verkettet und an das Referenzgenom v46 des T. brucei-Klons TREU927 angepasst, das von TriTrypDB29 mit Bowtie2106 heruntergeladen wurde, mit der Voreinstellung „sehr empfindlich-lokal“. Ausrichtungsoption festlegen. Die Alignments wurden in das BAM-Format konvertiert, nach Referenzen sortiert und mit SAMtools107 indiziert. Die Qualität der Ausrichtungen wurde mit Qualimap 2108 unter Verwendung der Optionen bamqc und rnaseq bewertet. Die Qualimap 2-Ausgabedateien wurden mit MultiQC109 aggregiert und überprüft. Die Alignments wurden mit dem Picard-Tools-Paket unter Verwendung der MarkDuplicates-Funktion (http://broadinstitute.github.io/picard/) dedupliziert; um das Potenzial einer Überrepräsentation der kürzesten RIT-seq-Fragmente zu minimieren. Ausrichtungen mit ordnungsgemäß gepaarten Lesevorgängen wurden mit SAMtool view mithilfe der Option -f 2 extrahiert und mit einem benutzerdefinierten Python-Skript analysiert, um die gepaarten Lesevorgänge zu extrahieren, die die Barcodesequenz (GTGAGGCCTCGCGA) in Vorwärts- oder Rückwärtskomplementausrichtung enthalten. Die Genomabdeckung der ausgerichteten Lesevorgänge wurde mit Deeptools im BedGraph-Format110 aus den BAM-Dateien extrahiert. Die Option „scaleFactor“ wurde verwendet, um jede Stichprobe in Bezug auf die Bibliotheksgröße zu normalisieren. Zunächst wurde der Mittelwert der Bibliotheksgröße aus allen Proben berechnet. Zweitens wurde der Mittelwert durch die Bibliotheksgröße jeder Stichprobe dividiert, um die Skalierungsfaktoren zu erhalten. Die bedGraph-Lesezuordnungsdateien wurden mit dem Python-Paket svist4get111 visualisiert. Lesezahlen für proteinkodierende Sequenzen und zugehörige nicht übersetzte Regionen (sofern mit Anmerkungen versehen) wurden aus den BAM-Dateien mithilfe von featureCounts112 ermittelt und auf Transcripts Per Kilobase Million (TPM) normalisiert. Die Dimensionsreduzierung der G1-, S- und G2M-TPM-Werte wurde mit dem Radviz-Algorithmus durchgeführt, der im Pandas-Python-Paket113 implementiert ist. Das Bash-Skript mit der Analysepipeline, eine Conda-Umgebungsspezifikationsdatei für deren Ausführung, das Python-Skript zum Extrahieren von Barcode-Lesevorgängen und ein einfaches Anwendungsbeispiel sind in GitHub verfügbar (https://github.com/mtinti/ritseq_cellcycle). Anschließend wurden die Daten mit einem GO-slim-Set und über tritrypdb.org verfügbaren Gen-Ontologie-Tools analysiert und mit den unter huygens.science.uva.nl/PlotsOfData verfügbaren Tools visualisiert.

Für den durch Tetracyclin induzierbaren Abbau der Tb927.10.970- oder Tb927.10.3970-Expression wurden Genfragmente entweder mit den PCR-Primern 970RiF (GATCGGGCCCGGTACCCGCCACACTGAACAACCTT) und 970RiR (GATCTCTAGAGGATCCTCCCTTTGCCGCCTTACCAC) oder mit den PCR-Primern 3970RiF (GATCGGGCCCGG) amplifiziert TACCGCGTCGGAGATGTGATCCTT) und 3970RiR (GATCTCTAGAGGATCCACAACTCGCATACACGGAGG) PCR-Primer isoliert und in zwei Teile kloniert Schritte in pRPaiSL 105. Die resultierenden Konstrukte wurden durch Sequenzierung bestätigt und vor der Transfektion mit AscI verdaut. Der Abbau von Tb927.10.970 wurde mithilfe der quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) bewertet. Die RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit mit einem DNase-Verdauungsschritt auf der Säule (RNase-freie DNase, Qiagen) extrahiert. RNA (1 μg) wurde unter Verwendung eines Hochleistungs-RNA-zu-cDNA-Kits (Thermo Fisher Scientific) revers transkribiert und das Äquivalent von 25 ng RNA wurde in jeder qPCR-Reaktion mit den Primern 970qRT_F (AGGAAGCGGAAGGAGAGGAT) und 970qRT_R (AGCGGAATTTATTGCGTTCGC) verwendet. Die Reaktionen wurden in technischen Dreifachansätzen auf einem QuantStudio3 (Applied Biosystems) unter Verwendung des Luna® Universal qPCR Master Mix (NEB) durchgeführt. TERT (Tb927.11.10190) wurde als Referenzgen verwendet, um den 2^-deltaCt-Wert für jede Probe zu berechnen. Für die N-terminale Markierung von Tb927.10.3970 wurde das Targeting-Fragment unter Verwendung der PCR-Primer 3970tagF (GATCTCTAGAGTAGGTGCTTCTTCCAAGC) und 3970tagR (GATCGGATCCCCGGAAGAGCACTAAGATCC) amplifiziert und entweder in 6 x myc- oder GFP-pNATTAGx-Markierungskonstrukte kloniert; Es wurden Versionen mit einem Blasticidin-auswählbaren Marker verwendet105. Der korrekte Zusammenbau wurde durch Sequenzierung bestätigt und diese Konstrukte wurden vor der Transfektion mit SalI linearisiert.

Pelletierte Zellen wurden in RIPA-Puffer mit 8 × 5 s Beschallungszyklen bei 5 µm Amplitude in einem Soniprep 150 Utrasonic Desintegrator (MSE) mit einem 23 kHz-Generator lysiert und 15 Minuten bei 4 ° C und maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Die Proteine ​​im Überstand wurden mittels SDS-PAGE und Standard-Blot-Verfahren aufgetrennt. Der Proteinnachweis wurde mithilfe des Maus-α-myc-Primärantikörpers Klon 9B11 (1:5.000) oder des Maus-α-EF1α-Primärantikörpers (Millipore, 1:20.000) mit Ziegen-α-Maus-Meerrettichperoxidase-gekoppeltem Sekundärantikörper (Biorad, 1:2000) erreicht. Blots wurden unter Verwendung des Enhanced Chemilumineszenz-Kits (Amersham) gemäß den Anweisungen des Herstellers entwickelt.

Die Zellen wurden in 1% Paraformaldehyd fixiert und durch Trocknen über Nacht an 5-mm-Objektträger mit 12 Vertiefungen (Thermo Scientific) befestigt. Nach der Rehydrierung in PBS für 5 Minuten wurden die Zellen 15 Minuten lang in 0,5 % Triton X-100 permeabilisiert und dreimal in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden 15 Minuten lang mit 50 % FBS in PBS blockiert und zweimal in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden zunächst jeweils 1 Stunde lang mit Kaninchen-α-GFP-Primärantikörper (Abcam, 1:250) und dann mit α-Kaninchen-Alexa-488-Sekundärantikörper (1:2000) inkubiert, gefolgt von 3 Wäschen in PBS. Die Objektträger wurden schließlich in Vectashield mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) montiert und vor der Bildgebung unter einem Deckglas versiegelt. Für die reine DAPI-Färbung wurden die Objektträger nach der Rehydrierung direkt in Vectashield mit DAPI montiert. Die Zellen wurden mit 63-facher Vergrößerung und Ölimmersion unter einem Zeiss Axiovert 200 M-Mikroskop mit Zen Pro-Software (Zeiss) abgebildet. Die Visualisierung und Quantifizierung von DAPI und GFP wurde in ImageJ (Fidschi) v1.53q durchgeführt. Zur Quantifizierung der Signalintensität wurden Partikel automatisch aus einem Binärbild des DAPI-Kanals definiert und anschließend wurden Kinetoplasten- und Kernpartikel manuell unterschieden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten wurden im Short Read Archive (SRA) unter dem Zugangscode PRJNA641153 hinterlegt. Die kartierten Daten können mit einem Online-Tool unter https://tryp-cycle.pages.dev/ visualisiert werden. Weitere Daten zu einzelnen Genen finden Sie unter tritrypdb.org. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Code für die RIT-seq-Datenanalyse114 (https://zenodo.org/record/7002689) und für das Online-Visualisierungstool115 (https://zenodo.org/record/7002687) sind in GitHub verfügbar.

Harashima, H., Dissmeyer, N. & Schnittger, A. Zellzykluskontrolle im gesamten eukaryotischen Königreich. Trends Zellbiol. 23, 345–356 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pollard, TD & O'Shaughnessy, B. Molekularer Mechanismus der Mytokinese. Annu Rev. Biochem. 88, 661–689 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Poon, RY Zellzykluskontrolle: Ein System miteinander verbundener Oszillatoren. Methoden Mol. Biol. 1342, 3–19 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Visconti, R., Della Monica, R. & Grieco, D. Zellzyklus-Checkpoint bei Krebs: ein therapeutisch zielbares zweischneidiges Schwert. J. Exp. Klin. Krebs Res. 35, 153 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Buscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V. & Priotto, G. Menschliche afrikanische Trypanosomiasis. Lancet 390, 2397–2409 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Matthews, KR 25 Jahre afrikanische Trypanosomenforschung: Von der Beschreibung über die molekulare Zerlegung bis hin zur Entdeckung neuer Arzneimittel. Mol. Biochem Parasitol. 200, 30–40 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Broadhead, R. et al. Die Beweglichkeit der Flagellen ist für die Lebensfähigkeit des Trypanosoms im Blutkreislauf erforderlich. Natur 440, 224–227 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Baron, DM, Kabututu, ZP & Hill, KL Rückwärts stecken geblieben: Der Verlust von LC1 bei Trypanosoma brucei stört die äußeren Dyneinarme und führt zu einem umgekehrten Flagellenschlag und einer Rückwärtsbewegung. J. Cell Sci. 120, 1513–1520 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bonnefoy, S. et al. Biallelische Mutationen in LRRC56, das für ein Protein kodiert, das mit dem intraflagellaren Transport assoziiert ist, verursachen mukoziliäre Clearance- und Lateralitätsdefekte. Bin. J. Hum. Genet. 103, 727–739 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Couton, C. et al. Mutationen in CFAP43 und CFAP44 führen bei Trypanosoma und Menschen zu männlicher Unfruchtbarkeit und Geißeldefekten. Nat. Komm. 9, 686 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Vincensini, L., Blisnick, T. & Bastin, P. [Die Bedeutung von Modellorganismen für das Studium der Zilien- und Flagellenbiologie]. Biol. Aujourdhui 205, 5–28 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Allmann, S. & Bringaud, F. Glykosomen: Ein umfassender Überblick über ihre metabolische Rolle in T. brucei. Int J. Biochem. Zellbiol. 85, 85–90 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wheeler, RJ, Gull, K. & Sunter, JD Koordination des Zellzyklus in Trypanosomen. Annu Rev. Microbiol. 73, 133–154 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Clayton, C. Regulierung der Genexpression bei Trypanosomatiden: Leben mit polycistronischer Transkription. Öffnen Sie Biol. 9, 190072 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, Q., Hu, H. & Li, Z. Neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der Mitose und Zytokinese in Trypanosomen. Int Rev. Cell Mol. Biol. 308, 127–166 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ploubidou, A., Robinson, DR, Docherty, RC, Ogbadoyi, EO & Gull, K. Hinweise auf neuartige Zellzyklus-Kontrollpunkte in Trypanosomen: Kinetoplastensegregation und Zytokinese ohne Mitose. J. Cell Sci. 112, 4641–4650 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Akiyoshi, B. & Gull, K. Entdeckung unkonventioneller Kinetochoren in Kinetoplastiden. Zelle 156, 1247–1258 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marques, CA & McCulloch, R. Konservierung und Variation von Strategien zur DNA-Replikation von Kinetoplastiden-Kerngenomen. Curr. Genomics 19, 98–109 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Archer, SK, Inchaustegui, D., Queiroz, R. & Clayton, C. Das durch den Zellzyklus regulierte Transkriptom von Trypanosoma brucei. PLoS One 6, e18425 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crozier, TWM et al. Proteomische Analyse des Zellzyklus der prozyklischen Form Trypanosoma brucei. Mol. Zellproteom. 17, 1184–1195 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Benz, C. & Urbaniak, MD Organisation des Zellzyklus ohne Transkriptionskontrolle: Dynamische Phosphorylierung koordiniert den Zellzyklus von Trypanosoma brucei posttranskriptionell. PLoS Pathog. 15, e1008129 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Glover, L. et al. RNAi-Screenings im Genommaßstab zur Hochdurchsatz-Phänotypisierung in blutkreislaufförmigen afrikanischen Trypanosomen. Nat. Protokoll. 10, 106–133 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Alsford, S. et al. Hochdurchsatz-Phänotypisierung mittels paralleler Sequenzierung von RNA-Interferenzzielen im afrikanischen Trypanosom. Genomres. 21, 915–924 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K. & Ullu, E. Doppelsträngige RNA induziert den mRNA-Abbau in Trypanosoma brucei. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 95, 14687–14692 (1998).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hammarton, TC, Clark, J., Douglas, F., Boshart, M. & Mottram, JC Stadiumsspezifische Unterschiede in der Zellzykluskontrolle bei Trypanosoma brucei, die durch RNA-Interferenz eines mitotischen Cyclins aufgedeckt wurden. J. Biol. Chem. 278, 22877–22886 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, Z., Umeyama, T. & Wang, CC Der chromosomale Passagierkomplex und ein mitotisches Kinesin interagieren mit der Tousled-like-Kinase in Trypanosomen, um Mitose und Zytokinese zu regulieren. PLoS One 3, e3814 (2008).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Alsford, S., Kawahara, T., Glover, L. & Horn, D. Das Markieren eines T. brucei-RRNA-Locus verbessert die stabile Transfektionseffizienz und umgeht induzierbare Expressionspositionseffekte. Mol. Biochem Parasitol. 144, 142–148 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kolev, NG, Tschudi, C. & Ullu, E. RNA-Interferenz bei Protozoenparasiten: Erfolge und Herausforderungen. Eukaryoten. Zelle 10, 1156–1163 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aslett, M. et al. TriTrypDB: eine funktionelle genomische Ressource für die Trypanosomatidae. Nukleinsäuren Res. 38, D457–D462 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Springer, AL et al. Die Stummschaltung einer mutmaßlichen schweren Dynein-Kette im Innenarm führt bei Trypanosoma brucei zu Flagellen-Immotilität. Mol. Biochem Parasitol. 175, 68–75 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gassen, A. et al. Für die Replikationsregulation in Trypanosoma brucei ist eine DOT1A-abhängige H3K76-Methylierung erforderlich. Nukleinsäuren Res. 40, 10302–10311 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choe, KN & Moldovan, GL Vorwärts durch die Dunkelheit: PCNA, immer noch der Hauptleiter an der Replikationsgabelung. Mol. Zelle 65, 380–392 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Valenciano, AL, Ramsey, AC & Mackey, ZB Eine Abweichung im Spiegel des proliferierenden Zellkernantigens in Trypanosoma brucei löst unterschiedliche Mechanismen zur Hemmung der Proliferation und des Fortschreitens des Zellzyklus aus. Zellzyklus 14, 674–688 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rudd, SG, Glover, L., Jozwiakowski, SK, Horn, D. & Doherty, AJ Die PPL2-Transläsionspolymerase ist für den Abschluss der chromosomalen DNA-Replikation im afrikanischen Trypanosom von wesentlicher Bedeutung. Mol. Zelle 52, 554–565 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ralston, KS, Lerner, AG, Diener, DR & Hill, KL Die Flagellenmotilität trägt zur Zytokinese bei Trypanosoma brucei bei und wird durch ein evolutionär konserviertes Dynein-Regulationssystem moduliert. Eukaryoten. Zelle 5, 696–711 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boehm, CM et al. Die Trypanosomen-Exozyste: Eine konservierte Struktur, die eine neue Rolle bei der Endozytose offenbart. PLoS Pathog. 13, e1006063 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Wang, DY, Kamuda, K., Montoya, G. & Mesa, P. Das TRiC/CCT-Chaperonin und seine Rolle bei der unkontrollierten Proliferation. Adv. Exp. Med. Biol. 1243, 21–40 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, Mol. Mikrobiol. 112, 1718–1730 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sunter, JD, Varga, V., Dean, S. & Gull, K. Eine dynamische Koordination der Flagellum- und zytoplasmatischen Zytoskelettanordnung bestimmt die Zellmorphogenese in Trypanosomen. J. Cell Sci. 128, 1580–1594 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, H., An, T., Kurasawa, Y., Zhou, Q. & Li, Z. Die Trypanosomen-spezifischen Proteine ​​FPRC und CIF4 regulieren die Zytokinese-Initiierung, indem sie CIF1 an der Zytokinese-Initiationsstelle rekrutieren. J. Biol. Chem. 294, 16672–16683 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Z. et al. Identifizierung eines neuartigen chromosomalen Passagierkomplexes und seiner einzigartigen Lokalisierung während der Zytokinese in Trypanosoma brucei. PLoS One 3, e2354 (2008).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Li, Z. & Wang, CC Veränderte Rollen der Aurora-B-Kinase in zwei Lebenszyklusstadien von Trypanosoma brucei. Eukaryoten. Zelle 5, 1026–1035 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, NG et al. Regulatoren des Zellzyklusfortschritts und der Differenzierung von Trypanosoma brucei mithilfe eines kinomweiten RNAi-Screenings identifiziert. PLoS Pathog. 10, e1003886 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hu, H., Liu, Y., Zhou, Q., Siegel, S. & Li, Z. Das Centriol-Cartwheel-Protein SAS-6 in Trypanosoma brucei ist für die Biogenese des Probasalkörpers und den Flagellumaufbau erforderlich. Eukaryoten. Zelle 14, 898–907 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, mSphere 4, e00199–19 (2019).

Dean, S., Moreira-Leite, F., Varga, V. & Gull, K. Das Cilium-Übergangszonen-Proteom enthüllt die Kompartimentierung und unterschiedliche Dynamik von Ciliopathie-Komplexen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 113, E5135–E5143 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dang, HQ et al. Proximitätsinteraktionen zwischen Basalkörperkomponenten bei Trypanosoma brucei identifizieren neue Regulatoren der Basalkörperbiogenese und -vererbung. mBio. 8, e02120–16 (2017).

An, T. & Li, Z. Ein verwaistes Kinesin steuert die Morphologieübergänge von Trypanosomen, indem es FLAM3 auf das Flagellum richtet. PLoS Pathog. 14, e1007101 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hu, L., Hu, H. & Li, Z. Ein Kinetoplastid-spezifisches Kinesin ist für die Zytokinese und die Aufrechterhaltung der Zellmorphologie in Trypanosoma brucei erforderlich. Mol. Mikrobiol. 83, 565–578 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeGrasse, JA et al. Hinweise auf eine gemeinsame Kernporenkomplexarchitektur, die vom letzten gemeinsamen eukaryontischen Vorfahren erhalten geblieben ist. Mol. Zellproteom. 8, 2119–2130 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Benz, C., Clucas, C., Mottram, JC & Hammarton, TC Zytokinese im Blutkreislaufstadium Trypanosoma brucei erfordert eine Familie von Kataninen und Spastin. PLoS One 7, e30367 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ralston, KS & Hill, KL Trypanin, ein Bestandteil des Flagellen-Dynein-Regulationskomplexes, ist im Blutkreislauf afrikanischer Trypanosomen essentiell. PLoS Pathog. 2, e101 (2006).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

May, SF et al. Das AIR9-ähnliche Protein von Trypanosoma brucei ist mit dem Zytoskelett assoziiert und wird für die Positionierung des Zellkerns und die genaue Platzierung der Spaltfurchen benötigt. Mol. Mikrobiol. 84, 77–92 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Portman, N. & Gull, K. Identifizierung paraloger lebenszyklusstadiumspezifischer Zytoskelettproteine ​​im Parasiten Trypanosoma brucei. PLoS One 9, e106777 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Dostalova, A., Kaser, S., Cristodero, M. & Schimanski, B. Der nukleare mRNA-Exportrezeptor Mex67-Mtr2 von Trypanosoma brucei enthält ein einzigartiges und essentielles Zinkfingermotiv. Mol. Mikrobiol. 88, 728–739 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marques, CA et al. Unterschiedliche Zusammensetzung und Regulierung des Ursprungserkennungskomplexes von Trypanosoma brucei, der die Initiierung der DNA-Replikation vermittelt. Nukleinsäuren Res. 44, 4763–4784 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gluenz, E., Sharma, R., Carrington, M. & Gull, K. Funktionelle Charakterisierung der Kohäsin-Untereinheit SCC1 in Trypanosoma brucei und Zerlegung mutierter Phänotypen in zwei Lebenszyklusstadien. Mol. Mikrobiol. 69, 666–680 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ammerman, ML et al. Architektur des Trypanosomen-RNA-Editierungs-Zubehörkomplexes MRB1. Nukleinsäuren Res. 40, 5637–5650 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zikova, A., Schnaufer, A., Dalley, RA, Panigrahi, AK & Stuart, KD Der F0F1-ATP-Synthase-Komplex enthält neuartige Untereinheiten und ist für prozyklisches Trypanosoma brucei essentiell. PLoS Pathog. 5, e1000436 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Salazar-Roa, M. & Malumbres, M. Den Zellteilungszyklus vorantreiben. Trends Zellbiol. 27, 69–81 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tudzarova, S. et al. Zwei Ubiquitin-Ligasen, APC/C-Cdh1 und SKP1-CUL1-F (SCF)-beta-TrCP, regulieren nacheinander die Glykolyse während des Zellzyklus. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 108, 5278–5283 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, JW, Sun, P., Zhang, DX, Xiong, WJ & Mi, J. Hexokinase 2 reguliert den G1/S-Checkpoint durch CDK2 in krebsassoziierten Fibroblasten. Cell Signal 26, 2210–2216 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Morgan, GA, Hamilton, EA & Black, SJ Die Anforderungen für die G1-Checkpoint-Progression von Trypanosoma brucei S 427 Klon 1. Mol. Biochem Parasitol. 78, 195–207 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Silvester, E., McWilliam, KR & Matthews, KR Die zytologischen Ereignisse und die molekulare Kontrolle der Lebenszyklusentwicklung von Trypanosoma brucei im Blutkreislauf von Säugetieren. Krankheitserreger 6, 29 (2017).

Qiu, Y. et al. Die Glukosesignalisierung ist wichtig für die Nährstoffanpassung während der Differenzierung pleomorpher afrikanischer Trypanosomen. mSphere 3, e00366–18 (2018).

Naguleswaran, A., Doiron, N. & Roditi, I. Die RNA-Seq-Analyse validiert die Verwendung von aus Kulturen stammendem Trypanosoma brucei und liefert neue Marker für Lebenszyklusstadien von Säugetieren und Insekten. BMC Genomics 19, 227 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Kalucka, J. et al. Stoffwechselkontrolle des Zellzyklus. Zellzyklus 14, 3379–3388 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burgers, PMJ & Kunkel, TA Eukaryotische DNA-Replikationsgabel. Annu Rev. Biochem. 86, 417–438 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mutomba, MC, To, WY, Hyun, WC & Wang, CC Die Hemmung der Proteasomaktivität blockiert das Fortschreiten des Zellzyklus an bestimmten Phasengrenzen in afrikanischen Trypanosomen. Mol. Biochem. Parasit. 90, 491–504 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tinti, M., Guther, MLS, Crozier, TWM, Lamond, AI & Ferguson, MAJ Proteomumsatz im Blutkreislauf und prozyklische Formen von Trypanosoma brucei, gemessen durch quantitative Proteomik. Willkommen, Open Res. 4, 152 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hayashi, H. & Akiyoshi, B. Der Abbau von Cyclin B ist entscheidend für die Kernteilung bei Trypanosoma brucei. Biol. Offen 7, bio031609 (2018).

Benz, C. & Clayton, CE Das F-Box-Protein CFB2 ist für die Zytokinese von Trypanosoma brucei in Blutform erforderlich. Mol. Biochem Parasitol. 156, 217–224 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Van Hellemond, JJ & Mottram, JC Das CYC3-Gen von Trypanosoma brucei kodiert für ein Cyclin mit einer kurzen Halbwertszeit. Mol. Biochem Parasitol. 111, 275–282 (2000).

Artikel PubMed Google Scholar

Ishii, M. & Akiyoshi, B. Charakterisierung der unkonventionellen Kinetochorkinasen KKT10 und KKT19 in Trypanosoma brucei. J. Cell Sci. 133, jcs240978 (2020).

Saldivia, M. et al. Targeting des Trypanosom-Kinetochors mit CLK1-Proteinkinase-Inhibitoren. Nat. Mikrobiol. 5, 1207–1216 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saldivia, M. et al. Ein CLK1-KKT2-Signalweg, der die Kinetochor-Assemblierung in Trypanosoma brucei reguliert. mBio. 12, e0068721 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Mugo, E. & Clayton, C. Die Expression des RNA-bindenden Proteins RBP10 fördert den Differenzierungszustand der Blutkreislaufform in Trypanosoma brucei. PLoS Pathog. 13, e1006560 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Minia, I. & Clayton, C. Regulierung eines posttranskriptionellen Regulators: Proteinphosphorylierung, -abbau und Translationsblockade bei der Kontrolle des Trypanosomen-Stress-Response-RNA-Bindungsproteins ZC3H11. PLoS Pathog. 12, e1005514 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Bishola Tshitenge, T. & Clayton, C. Wechselwirkungen des Zinkfingerdomänenproteins ZC3H28 von Trypanosoma brucei brucei. Parasitologie 149, 356–370 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bravo Ruiz, G., Tinti, M., Ridgway, M. & Horn, D. Kontrolle der Expression von Varianten-Oberflächenglykoproteinen durch CFB2 in Trypanosoma brucei und quantitative proteomische Verbindungen zu Translation und Zytokinese. mSphere 7, e0006922 (2022).

Melo do Nascimento, L. et al. Funktionelle Erkenntnisse aus einem Oberflächenantigen-mRNA-gebundenen Proteom. Elife 10, e68136 (2021).

Hammarton, TC, Kramer, S., Tetley, L., Boshart, M. & Mottram, JC Trypanosoma brucei Polo-like-Kinase ist für die Basalkörperduplikation, kDNA-Segregation und Zytokinese essentiell. Mol. Mikrobiol. 65, 1229–1248 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumar, P. & Wang, CC Dissoziation der Zytokinese-Initiierung von der mitotischen Kontrolle in einem Eukaryoten. Eukaryoten. Zelle 5, 92–102 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McAllaster, MR et al. Proteomische Identifizierung neuer Zytoskelettproteine, die mit TbPLK assoziiert sind, einem wesentlichen Regulator der Zellmorphogenese bei Trypanosoma brucei. Mol. Biol. Zelle 26, 3013–3029 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tu, J. Biol. Chem. 279, 20519–20528 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Menzies, SK, Tulloch, LB, Florence, GJ & Smith, TK Die Trypanosomen-Alternativoxidase: ein potenzielles Medikamentenziel? Parasitologie 145, 175–183 (2018).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Li, Z. & Wang, CC Ein PHO80-ähnliches Cyclin und ein B-Typ-Cyclin kontrollieren den Zellzyklus der prozyklischen Form von Trypanosoma brucei. J. Biol. Chem. 278, 20652–20658 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wei, Y., Hu, H., Lun, ZR & Li, Z. Centrin3 in Trypanosomen erhält die Stabilität eines Flagellen-Innenarm-Dyneins für die Zellmotilität aufrecht. Nat. Komm. 5, 4060 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Denninger, V. & Rudenko, G. FACT spielt eine wichtige Rolle bei der Histondynamik, die die Kontrolle der VSG-Expressionsstelle in Trypanosoma brucei beeinflusst. Mol. Mikrobiol. 94, 945–962 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prendergast, L. et al. Der CENP-T/-W-Komplex ist ein Bindungspartner des Histon-Chaperons FACT. Genes Dev. 30, 1313–1326 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dean, S., Sunter, JD & Wheeler, RJ TrypTag.org: Eine genomweite Proteinlokalisierungsressource für Trypanosomen. Trends Parasitol. 33, 80–82 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Halliday, C. et al. Zelluläre Wahrzeichen von Trypanosoma brucei und Leishmania mexicana. Mol. Biochem. Parasit. 230, 24–36 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haanstra, JR et al. Bekämpfung des Stoffwechsels von Krankheitserregern ohne Kollateralschäden für den Wirt. Wissenschaft. Rep. 7, 40406 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khare, S. et al. Proteasom-Hemmung zur Behandlung von Leishmaniose, Chagas-Krankheit und Schlafkrankheit. Natur 537, 229–233 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Torrie, LS et al. Identifizierung von Inhibitoren einer unkonventionellen Trypanosoma brucei Kinetochorkinase. PLoS One 14, e0217828 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Urbaniak, MD et al. Die chemische Proteomanalyse zeigt die Arzneimittelfähigkeit des Kinoms von Trypanosoma brucei. ACS Chem. Biol. 7, 1858–1865 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

El-Sayed, NM et al. Vergleichende Genomik von trypanosomatiden parasitären Protozoen. Wissenschaft 309, 404–409 (2005).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Mensa-Wilmot, K., Hoffman, B., Wiedeman, J., Sullenberger, C. & Sharma, A. Kinetoplastenteilungsfaktoren in einem Trypanosom. Trends Parasitol. 35, 119–128 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klebanov-Akopyan, O., Mishra, A., Glousker, G., Tzfati, Y. & Shlomai, J. Trypanosoma brucei UMSBP2 ist ein einzelsträngiges telomeres DNA-Bindungsprotein, das für den Chromosomenendschutz essentiell ist. Nukleinsäuren Res. 46, 7757–7771 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Milman, N., Motyka, SA, Englund, PT, Robinson, D. & Shlomai, J. Das mitochondriale Ursprungsbindungsprotein UMSBP vermittelt die DNA-Replikation und -Segregation in Trypanosomen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 104, 19250–19255 (2007).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sela, D. & Shlomai, J. Regulierung der UMSBP-Aktivitäten durch redoxempfindliche Proteindomänen. Nukleinsäuren Res. 37, 279–288 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chiu, J. & Dawes, IW Redoxkontrolle der Zellproliferation. Trends Zellbiol. 22, 592–601 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Currier, RB et al. Ein essentielles Protein vom Thioredoxin-Typ von Trypanosoma brucei fungiert als redoxreguliertes mitochondriales Chaperon. PLoS Pathog. 15, e1008065 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Groitl, B. & Jakob, U. Redoxschalter auf Thiolbasis. Biochim Biophys. Acta 1844, 1335–1343 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alsford, S. & Horn, D. Single-Locus-Targeting-Konstrukte für zuverlässige regulierte RNAi- und Transgenexpression in Trypanosoma brucei. Mol. Biochem. Parasit. 161, 76–79 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Langmead, B. & Salzberg, SL Schnelle Lücken-Lese-Ausrichtung mit Bowtie 2. Nat. Methoden 9, 357–359 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. et al. Das Sequence Alignment/Map-Format und SAMtools. Bioinformatik 25, 2078–2079 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Okonechnikov, K., Conesa, A. & Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: Erweiterte Multiproben-Qualitätskontrolle für Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten. Bioinformatik 32, 292–294 (2016).

CAS PubMed Google Scholar

Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S. & Kaller, M. MultiQC: Fassen Sie Analyseergebnisse für mehrere Tools und Proben in einem einzigen Bericht zusammen. Bioinformatik 32, 3047–3048 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramirez, F. et al. deepTools2: ein Webserver der nächsten Generation für die Deep-Sequencing-Datenanalyse. Nukleinsäuren Res. 44, W160–W165 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Egorov, AA et al. svist4get: ein einfaches Visualisierungstool für Genomspuren aus Sequenzierungsexperimenten. BMC Bioinforma. 20, 113 (2019).

Artikel Google Scholar

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: ein effizientes Allzweckprogramm zum Zuweisen von Sequenzablesungen zu genomischen Merkmalen. Bioinformatik 30, 923–930 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Virtanen, P. et al. SciPy 1.0: grundlegende Algorithmen für wissenschaftliches Rechnen in Python. Nat. Methoden 17, 261–272 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marques, CA, Ridgway, M., Tinti, M., Cassidy, A. & Horn, D. RNA-Interferenzprofilierung im Genommaßstab von Trypanosoma brucei-Zellzyklusprogressionsdefekten. GitHub. https://doi.org/10.5281/zenodo.7002689 (2022).

Marques, CA, Ridgway, M., Tinti, M., Cassidy, A. & Horn, D. RNA-Interferenzprofilierung im Genommaßstab von Trypanosoma brucei-Zellzyklusprogressionsdefekten. GitHub. https://doi.org/10.5281/zenodo.7002686 (2022).

Referenzen herunterladen

Wir danken R. Clark, A. Rennie und M. Lee von der Flow Cytometry and Cell Sorting Facility, die vom Wellcome Trust (097418/Z/11/Z) unterstützt wird. Wir danken außerdem L. Glover für Ratschläge zur Manipulation von RNAi-Bibliotheken, S. Hutchinson für Ratschläge zur RIT-seq-Datenanalyse und J. Faria und G. Bravo Ruiz für fruchtbare Diskussionen. Die Arbeit wurde durch Wellcome Trust Investigator Awards [100320/Z/12/Z und 217105/Z/19/Z an DH] finanziert. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -interpretation oder die Entscheidung, die Arbeit zur Veröffentlichung einzureichen.

Catarina A. Marques

Aktuelle Adresse: Wellcome Centre for Integrative Parasitology, University of Glasgow, 120 University Place, Glasgow, G12 8TA, UK

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Catarina A. Marques, Melanie Ridgway, Michele Tinti.

Wellcome Centre for Anti-Infectives Research, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH, Großbritannien

Catarina A. Marques, Melanie Ridgway, Michele Tinti und David Horn

Tayside Centre for Genomic Analysis, Ninewells Hospital and School of Medicine, Dundee, DD1 9SY, Großbritannien

Andrew Cassidy

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CAM, MR, AC und DH haben die Experimente entworfen. CAM und MR führten die Experimente durch. CAM, MR, MT und DH analysierten experimentelle Daten. MT führte die Datenkuratierung und -visualisierung durch. DH betreute das Projekt und akquirierte Fördermittel. CAM, MR, MT und DH haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit David Horn.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Marques, CA, Ridgway, M., Tinti, M. et al. Genommaßstäbliche RNA-Interferenzprofilierung von Zellzyklus-Progressionsdefekten von Trypanosoma brucei. Nat Commun 13, 5326 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33109-y

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Eingegangen: 05. Mai 2022

Angenommen: 31. August 2022

Veröffentlicht: 10. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33109-y

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